细菌尿素酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

细菌尿素酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过改良的尿素酶贝特罗反应系统中尿素转化为氨分子后峰值的变化，即采用比色法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心改良贝特罗反应（Berthelot Reaction）、成功实验证明的。其适用于各种细菌细胞裂解萃取液样品尿素酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

许多细菌产生细胞外酶（exoenzyme），称为水解酶（hydrolase），在水分子的参与下，催化底物的水解，成为细菌生理特征之一。其中尿素酶（Urease），裂解尿素分子为氨分子和二氧化碳，用以识别革蓝氏阴性细菌，例如变形杆菌属（Proteus group）和幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）等。细菌尿素酶在水分子的参与下，催化尿素的水解，产生氨分子，与次氯酸盐和水杨酸作用后呈现墨绿色和峰值的变化（波长600nm），来定量测定细菌细胞尿素酶的活性。贝特罗反应（Berthelot Reaction）系统为：

UREASE

UREA  +  H2O       →      2 NH3  +  CO2

          NITROPRUSSIDE  

NH3  +  CIO-  +  2 salicylate    →      GREEN DYE

NaOH

产品内容

缓冲液（Reagent A） 15毫升

反应液（Reagent B）     1.5毫升

底色液（Reagent C） 15毫升

标准液（Reagent D）     100微升

产品说明书     1份

保存方式

保存反应液（Reagent B）在-20℃冰箱里；其余的保存在在4℃冰箱里，避免光照，有效保证3月

用户自备

1.5毫升离心管：用于标准样品操作的容器

恒温水槽：用于孵育反应

比色皿：用于反应和比色的容器

分光光度仪：用于比色分析

 实验步骤

一、测定准备

1．准备好待测样品（例如细菌裂解萃取液等），置于冰槽里

2．设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长600nm，并置零 

3．准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

4．分别加入50微升缓冲液（Reagent A）到每个离心管

5．移取50微升标准液（Reagent D）到1号管，混匀

6．小心移取50微升1号管稀释的标准液（Reagent D）到2号管，混匀

7．小心移取50微升2号管稀释的标准液（Reagent D）到3号管，混匀

8．小心移取50微升3号管稀释的标准液（Reagent D）到4号管，混匀

9．将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

管号 缓冲液（Reagent A） 标准液（Reagent D） 测定体系氨分子浓度

1 50微升 50微升 100微摩尔/升

2 50微升 50微升1号管 50微摩尔/升

3 50微升 50微升2号管 25微摩尔/升

4 50微升 50微升3号管 12.5微摩尔/升

5 50微升 0 空白对照管

二、标准曲线测定

1．移取400微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2．加入50微升反应液（Reagent B）

3．加入50微升上述配制的标准液

4．加入500微升底色液（Reagent C）

5．上下倾倒数次，混匀

6．在37℃温度下孵育5分钟

7．即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数（A）（注意：实际读数＝标准液读数－空白对照管读数）

8．重复实验步骤1至6四次

9．构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位的实际读数；横座标（X轴）为标准氨分子浓度（微摩尔/升）

三、样品测定

1．移取400微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2．加入50微升反应液（Reagent B）

3．加入50微升待测样品（100微克细菌细胞裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）

4．上下倾倒数次，混匀

5．在37℃温度下孵育5分钟

6．加入500微升底色液（Reagent C）

7．上下倾倒数次，混匀

8．在37℃温度下孵育5分钟

9．即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数（A）（注意：实际读数＝样品读数－空白对照管读数）

10．根据标准曲线获得样品对应氨分子浓度

四、计算样品活性

[根据标准曲线获得样品对应氨分子浓度（微摩尔/升）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[ 0.05（样品容量；毫升）X 5（反应时间；分钟）]＝纳摩尔氨分子/分钟/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳摩尔氨分子/分钟/毫克

纳摩尔氨分子/分钟/毫升或纳摩尔氨分子/分钟毫克 X 2 =纳摩尔氨分子/分钟/毫升或毫克

注意事项

1．本产品为25次（比色皿）操作，包括标准液

2．操作时，须戴手套

3．底色液（Reagent C）含有碱性物质，注意操作安全

4．一次操作过程中，标准液测定只需1次

5．样品须澄清，至关重要（本公司提供细菌可溶性总蛋白制备试剂盒－30022.1）

6．样品中避免含有氨类和氟化物，否则干扰检测

7．孵育反应完成后即刻进行比色测定；通常3至5分钟完成反应孵育

8．比色测定后，比色皿须清洗*

9．建议待测样本的蛋白浓度为100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1） 

10．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

11．酶活性单位浓度定义：在37℃下，pH 7.0的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解1纳摩尔尿素为2纳摩尔氨分子

12．本公司提供系列细菌生理生化检测试剂产品

质量标准

1．本产品经鉴定性能稳定

2．本产品经鉴定检测敏感