优化蛋白相互作用

如何对比较弱的相互作用进行研究？

生物体中有时执行细胞功能的是一些表达量低，与其它蛋白相互作用弱的蛋白质，要对这些相互作用进行分析，Y2H常常不能奏效——酵母双杂是在体内进行分析，因此对于一些低丰度，蛋白相互作用弱的关系就不能准确的描绘，因此需要寻找其它的一些方法。

耶鲁大学基因组与蛋白质组研究中心的Mike Snyder在完成他的一篇发表在《美国国家*院刊》（PNAS）杂志上的文章（寻找拟南芥蛋白质组中钙调蛋白CaM和类钙调蛋白CML（calmodulin-like）直接绑定蛋白，PNAS 104:4730-5, 2007）的时候找到了这样一种方法：蛋白芯片方法。

在这篇文章中，Snyder教授等人表达了1133个植物蛋白，并将这些蛋白及拷贝放置于硝化纤维膜包被玻片上，进行蛋白芯片研究，然后利用7种荧光标记的CaM和CML蛋白作为探针，结果发现了173个蛋白伴侣。

Snyder的实验室在蛋白芯片研究方法处于世界位置——曾于2001描绘了酵母蛋白质组芯片。Snyder认为芯片实验具有几个优点，首先由于是体外实验，因此观察到的相互作用都是直接作用的，有中间介导的是不会出现的；第二，芯片能进行结合强度的直接比较，将相互作用强弱进行排行——这是其它方法获得的数据无法比较的；zui后由于芯片上所有蛋白都是相同的数量，因此可以检测到拷贝数非常低的蛋白相互作用。

但另一方面，也正是由于芯片探针是体外进行的反应，因此结果需要在体内进行验证，而且芯片实验可能对于一些研究人员来说确实比较贵和操作上比较繁琐。

目前商业性的蛋白芯片产品比较少，Snyder实验室将他们的*给了Invitrogen，由此Invitrogen创造出了Protoarray系列产品。其中Yeast ProtoArray? PPI （Protein-Protein Interactions） microarray就是一种在蛋白组水平上阐明蛋白之间的相互作用的高密度蛋白微阵列。

相比较与Y2H，ProtoArray不需要花费数周时间，由于所有的酵母蛋白固定在玻片上，因此可以在一次实验，短至4小时内针对酵母蛋白组筛选标记的目的蛋白，以阐述针对超过4000种蛋白的蛋白相互作用，基本过程包括：封闭（1小时），加入*标记的探针；洗涤（10分钟），加入Alexa Fluor? 647耦联的链霉亲和素检测（30分钟）；洗涤、干燥和扫描（1小时）。

ProtoArray的一个重要就是确保对相互作用的zui大搜索，我们都知道，保持芯片蛋白处于有相互作用功能的状态是利用这种方法研究蛋白相互作用的重要前提，但是要所有蛋白都保证这一点是不可能的。为了能尽可能达到这个要求，ProtoArray在芯片波片上包被上了硝化纤维，而已知硝化纤维与种类广泛的蛋白功能相兼容，这一点Invitrogen的技术人员进行了确认.

而且ProtoArray可以在不同条件下分析蛋白相互作用，阐述动态的相互作用，比如使用不同蛋白修饰状态如磷酸化或者糖基化，不同的蛋白浓度，或者改变反应条件如离子强度，pH值或者温度，添加辅助因子（cofactor）如二价阳离子，这些不仅可以帮助检测出各种蛋白相互作用，而且可以更加地了解正在研究的相互作用的生物化学原理。

另外，正如上文提及的，ProtoArray是以Snyder实验室来源于酵母收集库的优良蛋白基础上建立的，这个收集库是由克隆到5’GST融合的酵母表达载体的开放阅读框，通过融合GST标签，蛋白可以很容易地在天然状态下，以高通量的方式快速纯化，可以收集到更多功能蛋白。