还原型(GSH)样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 准确称取0.g组织或收集500万细胞,加入mL试剂一和0uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆 600g,4℃离心5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,00g,4℃离心0min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的 NOX(此步可选做)。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔0秒,重复30次),用于NOX活性测定。
血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至600nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
()试剂四于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入0μL样本、200μL试剂四和40μL试剂五,混匀,记录600nm处20s时吸光值A和min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A-A2。
NOX 活力单位的计算
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
、血清(浆)NOX活力的计算:
单位的定义:每mL血清(浆)在每mL反应体系中每分钟A600变化0.0定义为一个酶活力单位。
NOX(U/mL)=ΔA×V反总÷V样÷0.0÷T=2500×ΔA
2、组织、细菌或细胞中NOX活力的计算:
()按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A600变
Bis-Acrylamide 25g/00g Amresco 072
(甲叉双丙烯酰铵)
BisBenzimideHoechstNo.33258 25mg/00mg/500mg Sigma B-2883
(荧光染料)
BisBenzimideHoechstNo.33342 25mg/00mg/500mg Sigma B226
(荧光染料)
Bis-Tris 25g/00g/kg原装 Amresco 075
Bis-TrisPropane 5g/25g/500g原装 Sigma B6755
Bluo-Gal 00mg原装/g原装 INALCO758-0750
(5-Bromo-3-Indolyl-β-D-
Galactopyranoside)
BM-Cyclin 37.5mg原装 Roche 799050
(支原体抑制剂)
Boricacid 250g/500g/kg Amresco 0588
(硼酸)
BrainHeartInfusion 00g原装/500g原装 BD
(脑心浸液
(无琼脂))
BrainHeartInfusionAgar 00g原装 BD 2065
(脑心浸液琼脂)
BrainHeartInfusionAgar 500g原装 BD 24820
(脑心浸液琼脂)
BrainInfusionPower kg 国产
(脑浸粉)