灌胃
1. 准备药物和灌胃器械
2. 抓取老鼠
3. 灌胃
注意事项:
1) 抓取老鼠时,可以戴大手套,但是操作起来会很不方便;建议只戴橡胶手套或不戴手套。左手大拇指
和食指从耳后固定老鼠头部,将颈部皮肤抓紧,使头部不能转到(但也不要窒息),剩余手指将老鼠
背部皮肤抓紧,使其身体不能扭动。使其和身体成一直线。可以两人配合,但是会浪费时间,更增加
灌胃难度;强烈建议一人独立操作。
2) 老鼠抓好后,要正确持针,中指、无名指和大拇指夹住针体,食指放在推塞上;针务必要沿口角进入,
大概进入针体的2/3 即可将药物注射入胃,注意进针不顺时切忌用力,应重新进针。如果当时药物没
有流出,既可确认灌胃成功,如果流出则失败。
3) 在正式实验灌胃前,务必先练习。首先不要惧怕老鼠,其次不要先老鼠脏(清洁级老鼠很干净的),
再次,不能生硬,不要让老鼠紧张。
4) 熟能生巧,边学习边练习边思考方能学好。
2VO 模型
1. 准备手术器械
2. 麻醉
3. 去除颈部毛
4. 切开中正颈部皮肤,分离肌肉、血管、神经
5. 分离目标血管,双线结扎,血管无需剪断
6. 缝合伤口
注意事项:
1) 缝合线用 4 号线;
2) 麻药目前本实验室暂时使用水合氯醛,一般是10%的,按照350mg/kg 量给药,由于老鼠对药物的耐
受差异较大,醉把握不好死亡率较高;麻醉不足时,补药不超过前总量的10%,补药时非常容易
导致死亡,且等待时间会明显延长;麻醉过度则可进行口腔插管和辅助呼吸,如果均不行,则死亡
放弃。)
3) 分离血管时务必不能将神经损伤。
4) 出麻醉状态的老鼠体温调节失衡,所以手术过程中注意保温;
5) 老鼠体重在 250-280g 左右实验,死亡率zui低;
6) 打麻药时注意:首先正确抓取老鼠(见灌胃操作规程),再次将老鼠头朝下倒置成30 度角,右手持
针,腹中线和两后腿中间连线相交处进针,回抽后,注射。此法标准、简便、快速。
7) 总之,在正式实验前边学习边练习边思考方能学好,熟能生巧。有不足之处,敬请各位老师同学批
评指正,以使该实验更加臻美。
灌 注
1. 准备好器械和灌注液;
2. 取老鼠,按照 350mg/kg 水合氯醛麻醉,可适当过量;
3. 将老鼠腹腔胸腔打开,分离出心脏;
4. 将针插入左心室,剪破右心耳;
5. 调节针头位置,使水流zui大;
6. 血液颜色明显变浅后,换甲醛液,抽搐完成后,将水流调为每秒一滴;
7. 将针头和心脏固定;固定至少 40min 后取脑;
8. 将取出的大脑放在 4%甲醛液保存。
注意事项:
1) 灌注液用量:0.9%生理盐水每只350ml~450ml,0.4%甲醛300ml~400ml 之间;生理盐水适当多一
些可以保证血液冲洗*;甲醛固定时间长些,大脑充分固定,有利于取脑和后续试验;
2) 进针前要保证针头处没有气泡,以免进入血管影响灌注;
3) 在抽搐完成前,不要将心脏用夹子夹,而是用手拿,这样可以保证水流速度和心脏完整;待
抽搐完成后,再夹住;
4) 进针时,不能太猛,以免针头进入右心室内,进针后,适当调节,注意不要进入左心房;
5) 灌注完成后,将管道冲洗一下,收拾器械;
6) 取脑注意:
*, 将大脑剪下,去除脑后肌肉和椎骨,露出枕骨大孔;
第二, 将头部皮肤剪开,并将两侧咬肌剥离;
第三, 然后用大剪刀将枕骨打孔纵向和横向切开三个口,⊥字型切口;
第四, 用止血钳将头骨掀开,注意不要触到大脑;
第五, 头盖骨掀开后,小心将脑膜剥离;
第六, 将附着咬肌的两块骨头可适当掀开;(此步可以省略)
第七, 如果力气足够,可以一手将老鼠头握紧,另一手用力击打手腕,直接将大脑震抖出来,
这样可以保证大脑完整,且节省时间;强烈建议此方法,女生基本都能抖出来。如果不
行再进行第五步或第七步操作;
第八, 如果力气不够,则慢慢取出:1,小心将后脑掀开,剪断脑下链接的神经,2,看大脑可
以自由活动时,再用力抖,可将大脑抖出,注意不要甩到地上;3,若不能抖出,再小心
将前面的神经链接剪断即可出来。不过此方法很容易将大脑损伤,切浪费时间,对技术
要求很高,建议尽量不要用方法。
7) 总之,在正式实验前边学习边练习边思考方能学好,熟能生巧。
切 片
1. 将在甲醛中固定的大脑先浸泡到 20%的蔗糖,使其沉下去,再转到30%的蔗糖,使其沉下,才能进
行切片;
2. 提前一天预约使用冰冻切片机;
3. 取浸泡好的大脑,根据切片所需部位,对大脑进行修整,使其底端平整,易于放在载物钉上;
4. 取载物钉放入切片机箱冷冻后,用 OCT 或PBS 制作平台,平台厚度大约3mm,将其面修平整;
5. 将修平整的大脑放到载物钉上,用 PBS 固定,大约10-15min,后可进行切片,根据实验需要对大脑
进行再修正;
6. 切片厚度根据实验所需,适当调整,一般脑片为 35-40?m;
7. 一般切 5 张片子取一次,但更要根据实际情况取;
注意:
1) 蔗糖沉下去的标准是,震荡后仍能很快沉下;
2) 其他切片注意事项,见切片机上的注意事项;
3) 总之,在正式实验前边学习边练习边思考方能学好,熟能生巧。有不足之处,敬请各位老师同学批评
指正,以使该实验更加臻美。
染 色
HE 染色
丙酮固定 1-2min
水洗 5s
苏木精染色 4-5min
水洗5s
分化液 7-8s
水洗
伊红 20-30s
水洗
Nissl 染色
氯仿 5min
丙酮 15min
100%酒精 30s
95%酒精 30s
70%酒精 30s
蒸馏水过 2 次
焦油紫染色液 20min
水过 3 次
70%酒精 60s
95%酒精 60s
100%酒精 90s
氯仿 5min
分化剂(拿进去即出来)
95%酒精过一下
100%酒精过一下
100%酒精过一下
二甲苯 透明 1min 2min 3min 三次
附录:焦油紫染色配方:1%焦油紫溶液中加冰醋酸,ph=3.75-3.85
尼氏分化剂:于95%乙醇中滴加冰醋酸 ph=4.1,此pH 很难调,有文献记载1~3 滴冰醋酸。
H&E 分化液:0.3%氢氧化铵(氨水),或者1%盐酸酒精(70%酒精99ml+1ml 盐酸)。
注意:
1) 染色时间和冲洗时间要根据片子的厚度,适当调整染色时间和冲洗时间;
2) 很多染液有挥发性和毒性,实验时注意保护自己,在柜子中操作;
3) 染色前晾干标准是,片子周边泛白;
4) 总之,在正式实验前边学习边练习边思考方能学好,熟能生巧。
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