牛牛天天人人综合影院 大鼠手术及取材实验操作规程

灌胃
1. 准备药物和灌胃器械
2. 抓取老鼠
3. 灌胃
注意事项：
1） 抓取老鼠时，可以戴大手套，但是操作起来会很不方便；建议只戴橡胶手套或不戴手套。左手大拇指
和食指从耳后固定老鼠头部，将颈部皮肤抓紧，使头部不能转到（但也不要窒息），剩余手指将老鼠
背部皮肤抓紧，使其身体不能扭动。使其和身体成一直线。可以两人配合，但是会浪费时间，更增加
灌胃难度；强烈建议一人独立操作。
2） 老鼠抓好后，要正确持针，中指、无名指和大拇指夹住针体，食指放在推塞上；针务必要沿口角进入，
大概进入针体的2/3 即可将药物注射入胃，注意进针不顺时切忌用力，应重新进针。如果当时药物没
有流出，既可确认灌胃成功，如果流出则失败。
3） 在正式实验灌胃前，务必先练习。首先不要惧怕老鼠，其次不要先老鼠脏（清洁级老鼠很干净的），
再次，不能生硬，不要让老鼠紧张。
4） 熟能生巧，边学习边练习边思考方能学好。

2VO 模型
1. 准备手术器械
2. 麻醉
3. 去除颈部毛
4. 切开中正颈部皮肤，分离肌肉、血管、神经
5. 分离目标血管，双线结扎，血管无需剪断
6. 缝合伤口
注意事项：
1） 缝合线用 4 号线；
2） 麻药目前本实验室暂时使用水合氯醛，一般是10%的，按照350mg/kg 量给药，由于老鼠对药物的耐
受差异较大，醉把握不好死亡率较高；麻醉不足时，补药不超过前总量的10%，补药时非常容易
导致死亡，且等待时间会明显延长；麻醉过度则可进行口腔插管和辅助呼吸，如果均不行，则死亡
放弃。）
3） 分离血管时务必不能将神经损伤。
4） 出麻醉状态的老鼠体温调节失衡，所以手术过程中注意保温；
5） 老鼠体重在 250-280g 左右实验，死亡率zui低；
6） 打麻药时注意：首先正确抓取老鼠（见灌胃操作规程），再次将老鼠头朝下倒置成30 度角，右手持
针，腹中线和两后腿中间连线相交处进针，回抽后，注射。此法标准、简便、快速。
7） 总之，在正式实验前边学习边练习边思考方能学好，熟能生巧。有不足之处，敬请各位老师同学批
评指正，以使该实验更加臻美。

灌 注
1. 准备好器械和灌注液；
2. 取老鼠，按照 350mg/kg 水合氯醛麻醉，可适当过量；
3. 将老鼠腹腔胸腔打开，分离出心脏；
4. 将针插入左心室，剪破右心耳；
5. 调节针头位置，使水流zui大；
6. 血液颜色明显变浅后，换甲醛液，抽搐完成后，将水流调为每秒一滴；
7. 将针头和心脏固定；固定至少 40min 后取脑；
8. 将取出的大脑放在 4%甲醛液保存。
注意事项：
1） 灌注液用量：0.9%生理盐水每只350ml~450ml，0.4%甲醛300ml~400ml 之间；生理盐水适当多一
些可以保证血液冲洗*；甲醛固定时间长些，大脑充分固定，有利于取脑和后续试验；
2） 进针前要保证针头处没有气泡，以免进入血管影响灌注；
3） 在抽搐完成前，不要将心脏用夹子夹，而是用手拿，这样可以保证水流速度和心脏完整；待
抽搐完成后，再夹住；
4） 进针时，不能太猛，以免针头进入右心室内，进针后，适当调节，注意不要进入左心房；
5） 灌注完成后，将管道冲洗一下，收拾器械；
6） 取脑注意：
*， 将大脑剪下，去除脑后肌肉和椎骨，露出枕骨大孔；
第二， 将头部皮肤剪开，并将两侧咬肌剥离；
第三， 然后用大剪刀将枕骨打孔纵向和横向切开三个口，⊥字型切口；
第四， 用止血钳将头骨掀开，注意不要触到大脑；
第五， 头盖骨掀开后，小心将脑膜剥离；
第六， 将附着咬肌的两块骨头可适当掀开；（此步可以省略）
第七， 如果力气足够，可以一手将老鼠头握紧，另一手用力击打手腕，直接将大脑震抖出来，
这样可以保证大脑完整，且节省时间；强烈建议此方法，女生基本都能抖出来。如果不
行再进行第五步或第七步操作；
第八， 如果力气不够，则慢慢取出：1，小心将后脑掀开，剪断脑下链接的神经，2，看大脑可
以自由活动时，再用力抖，可将大脑抖出，注意不要甩到地上；3，若不能抖出，再小心
将前面的神经链接剪断即可出来。不过此方法很容易将大脑损伤，切浪费时间，对技术
要求很高，建议尽量不要用方法。
7） 总之，在正式实验前边学习边练习边思考方能学好，熟能生巧。

切 片
1. 将在甲醛中固定的大脑先浸泡到 20%的蔗糖，使其沉下去，再转到30%的蔗糖，使其沉下，才能进
行切片；
2. 提前一天预约使用冰冻切片机；
3. 取浸泡好的大脑，根据切片所需部位，对大脑进行修整，使其底端平整，易于放在载物钉上；
4. 取载物钉放入切片机箱冷冻后，用 OCT 或PBS 制作平台，平台厚度大约3mm，将其面修平整；
5. 将修平整的大脑放到载物钉上，用 PBS 固定，大约10-15min，后可进行切片，根据实验需要对大脑
进行再修正；
6. 切片厚度根据实验所需，适当调整，一般脑片为 35-40?m；
7. 一般切 5 张片子取一次，但更要根据实际情况取；
注意：
1） 蔗糖沉下去的标准是，震荡后仍能很快沉下；
2） 其他切片注意事项，见切片机上的注意事项；
3） 总之，在正式实验前边学习边练习边思考方能学好，熟能生巧。有不足之处，敬请各位老师同学批评
指正，以使该实验更加臻美。

染 色
HE 染色
丙酮固定 1-2min
水洗 5s
苏木精染色 4-5min
水洗5s
分化液 7-8s
水洗
伊红 20-30s
水洗
Nissl 染色
氯仿 5min
丙酮 15min
100%酒精 30s
95%酒精 30s
70%酒精 30s
蒸馏水过 2 次
焦油紫染色液 20min
水过 3 次
70%酒精 60s
95%酒精 60s
100%酒精 90s
氯仿 5min
分化剂（拿进去即出来）
95%酒精过一下
100%酒精过一下
100%酒精过一下
二甲苯 透明 1min 2min 3min 三次
附录：焦油紫染色配方：1%焦油紫溶液中加冰醋酸，ph=3.75-3.85
尼氏分化剂：于95%乙醇中滴加冰醋酸 ph=4.1，此pH 很难调，有文献记载1~3 滴冰醋酸。
H&E 分化液：0.3%氢氧化铵（氨水），或者1%盐酸酒精（70%酒精99ml+1ml 盐酸）。
注意：
1） 染色时间和冲洗时间要根据片子的厚度，适当调整染色时间和冲洗时间；
2） 很多染液有挥发性和毒性，实验时注意保护自己，在柜子中操作；
3） 染色前晾干标准是，片子周边泛白；
4） 总之，在正式实验前边学习边练习边思考方能学好，熟能生巧。