Cy3 NHS ester/Cy5 NHS ester/Cy7 NHS ester（菁染料琥珀酰亚胺酯）的使用说明书包含标记抗体蛋白和小鼠体内活体成像实验步骤。
Sulfo Cy3 NHS ester/ Sulfo Cy5 NHS ester/ SulfoCy7 NHS ester（水溶性磺酸基菁染料琥珀酰亚胺酯）的使用说明书包含标记抗体蛋白和小鼠体内活体成像实验步骤。
菁染料是近红外荧光染料中zui常用的一类荧光染料，统的可见光染料相比有显著的优势。由于细胞和组织的自发荧光在近红外波段zui小，因此在检测复杂生物系统时，近红外染料能提供更高的特异性和灵敏度。同时，由于光波在近红外区段的组织透过性更好。菁染料的摩尔吸光系数在荧光染料中是zui高的，Cy5 hydrazide, Cy3 amine 和Cy7 NHS ester 的吸收在近红外区背景非常低，是荧光强度zui高、zui稳定的长波长染料。特别适合于活体小动物体内成像代替放射性元素。
磺酸化菁染料和非磺酸化菁荧光染料可以用于标记各种不同的目标分子：
- 可在有机溶剂中溶解的蛋白质
- 抗体 (use 5-10% of DMSO/DMF)
- DNA和寡核苷酸
- 多肽
- 其他小分子，包括药用小分子及抑制剂
磺酸化菁荧光染料可用于：
- 在DMF或DMSO中变性的敏感蛋白
- 被透析及纯化的蛋白
- 水溶性的纳米粒子
- 不溶或疏水的蛋白
非磺酸化菁荧光染料可用于：
产品说明：
菁染料是性能优良的荧光标记染料，摩尔吸光系数在荧光染料中是zui高的，其琥珀酰亚胺酯是zui常用的脂肪氨基标记试剂，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。通过改变次甲基链的长度，可改变其荧光发射波长，每增加一个双键，按照Huoffman 规则正好红移约100nm。
菁染料Cy3 和Cy5 已成为基因芯片的荧光标记物；另外，Cy5， Cy5.5 和Cy7 的吸收在近红外区背景非常低，是荧光强度zui高、zui稳定的长波长染料。特别适合于活体小动物体内成像代替放射性元素。但由于菁染料，尤其是不对称菁染料的合成副反应多，副产物极性相近，产物的分离提纯相当困难。菁染料特别是水溶性菁染料分子极性大，分离提纯越加困难。
Cyanine3 NHS ester（Cy3@SE）
Cyanine5 NHS ester（Cy5@SE）
Cyanine7 NHS ester（Cy7@SE）
Sulfo Cyanine3 NHS ester（SF Cy3@SE）
Sulfo Cyanine5 NHS ester（SF Cy5@SE）
Sulfo Cyanine7 NHS ester（SF Cy7@SE）
图1. 脂溶性菁染料琥珀酰亚胺酯的结构式 图2. 水溶性菁染料琥珀酰亚胺酯的结构式
图3 菁染料琥珀酰亚胺酯的激发和发射波长光谱图
菁染料琥珀酰亚胺酯（Cy3 NHS）的标记：
菁染料和生物分子的比例F/P=4～12之间荧光强度zui高， F/P值过高荧光探针会自我淬灭并影响生物分子的生物活性，标记生物分子是用单琥珀酰亚胺酯，但是用双修饰的CyDye NHS并没有发现交联。CyDye NHS标记抗体在pH (8.5～9.4)时10分钟F/P可达5～6，而在pH 7.0几乎不反应。我们用不同比例的Cy3标记anti-glutathione-S-transferase(GST)多克隆抗体发现用1:1，5:1，10:1 和 20:1标记时得到的F/P值分别是 0.28:1，1.16:1，2.3:1和4.6:1。
操作步骤：
一、 水溶性Cy3 NHS ester标记anti-GST多克隆抗体
市场上买到的抗体如果含有其它蛋白（例如serum albumin或gelatin等）或带氨基的缓冲液会影响标记，在标记前需纯化。
1. 在1 L 0.15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗体(浓度为 0.5 mL at3 mg/mL)，常温透析4小时。
2. 在4°C用新鲜的1 L 0.15 MNaCl 溶液再透析过夜。
3. 第二天用1 L 0.1 M NaHCO3 (pH 8.3)透析4小时。
4. 用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。
5. 用0.1 M NaHCO3 稀释少量的抗体，在280nm处测其紫外吸收值计算标记抗体的总量 （IgGantibody摩尔吸光系数170 000 M-1 cm-1 at 280 nm).
6. 用DMSO配置Cy3 NHS (MW765.95) 溶液浓度为10 mg/mL；计算所需体积以得到想要的CyDye NHS 和抗体的比值(例如20:1)，然后慢慢将其加入到抗体溶液中，同时在暗处常温缓慢搅拌45分钟。
7. 用1 L 0.15 M NaCl 溶液常温避光透析4小时除去未标记上的Cy3。
8. 在4°C用新鲜的1 L 0.15 MNaCl 溶液再避光透析过夜。
9. 用1 L of 0.01 M PBS/ 0.01% *溶液常温避光透析4小时， 在4°C常温避光再次透析过夜。
10. 用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。
11. 用0.01 M PBS/0.01 % *整数倍稀释标记抗体溶液，测量280nm（蛋白）和552nm（Cy）处的紫外可见吸光度。
12. 产品冷冻干燥成粉末或在0.01 M PBS/ 0.01% *溶液中，-20℃避光储存。
F/P计算：
Cy3在552nm摩尔吸光系数为150 000M-1cm-1；此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170 000
M-1cm-1；不同蛋白的摩尔吸光系数不一样；Cy3 染料本身在280 nm 的吸收是552nm处的8%。
按以下公式计算F/P值。
[Cy3] = A552/150000
[antibody] = {A280 - (0.08×A552)}/170000
F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A552}/{A280 - (0.08×A552)}
二、 水溶性Cy5 NHS ester标记 (D-ser2)-leucineenkephalin
1. Cy5 NHS 1.0 mg溶解于400 μL DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser2)-leucine- enkephalinacetate(YSGFLT，0.75 mg) 的400 μL DMSO溶液。（Dye 和peptide 投料比是 1:1）
2. 然后加入15 μL三乙胺，常温避光搅拌反应混合物过夜。
3. 用HPLC 纯化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上样注入2×400 μL，30分钟梯度洗脱。从0.1% TFA水溶液到MeCN∶H2O（0.1% TFA）=70∶30，流速4mL /min。（对不同的蛋白选择不同的合适HPLC梯度流动相）
4. 收集适当的色带峰，标记多肽的保留时间比未标记的多肽长。
5. 产品冷冻干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光储存；必要时可用质谱表征。
6. CyDye标记的蛋白稳定性取决于蛋白本身。例如标记的IgG在4 ℃可避光保存2月；更长期的保存需加入等体积的甘油-20 ℃避光保存。
F/P计算：
Cy5 在650 nm 的摩尔吸光系数为250 000 M-1cm-1 ，所用蛋白在280 nm处的摩尔吸光系数为170000M-1cm-1；Cy5在280nm处的吸收是650nm处的5%。按以下公式计算F/P值。
[Cy5 dye] = (A650)/250 000
[peptide] =[A280 -(0.05×A650)]/170000
F/P final= [dye]/[peptide]= {0.68×A650}/{A280 - (0.05×A650)}
三、 水溶性Sulfo Cy3 NHS ester 标记OLIGO
氨基封端的OLIGO可以标记CyDye SE，但是非常困难；标记前因为OILGO经氨水脱保护，请务必洗涤掉所有的残余氨水。然后将样品真空干燥；然后溶于0.25ml 的0.5 M NaCl 溶液中，用Sephadex G-50脱盐，用5.0 mM borate 缓冲液平衡到pH=8.0，然后用以上硼酸缓冲液冲下OLIGO。
然后浓缩至干的样品溶于0.1M carbonate buffer (pH 8.5-9.0)；在0.5mL碳酸缓冲液中30nmoles的OLIGO加入到CyDye SE的玻璃瓶中室温避光，密闭搅拌反应60min。反应物经Sephadex G-50或RP-HPLC过柱纯化，冷冻干燥后避光保存。
注意：Oligonucleotides和oligopeptides由于太小经常会留在过滤膜上或在冻存管内贴壁成膜，而无法标记。
四、 小动物活体成像领域的应用
活体动物体内成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。小动物活体成像是近年来在生物医药方面非常活跃和前沿的领域，在研究细胞行为，药物活性和代谢，疾病的进展等方向取得了革命性的进步。分为生物发光成像（以Caliper和Xengon 仪器为代表）和荧光成像（以KODAK 和CRI 仪器为代表）。
1、荧光成像的推荐步骤：
（1） SPF级 BALB/C裸鼠，6～8 周龄，18～20克，实验前24 h 自由进食、饮水。
（2） 于实验裸鼠腹腔内注射2%戊巴比妥钠300μL(215mg/ kg)麻醉动物。将裸鼠俯卧位平放于小动物多光谱活体成像系统的记录暗箱中。实验时将Cy7或Cy7标记的生物分子或药物溶于水（或甲醇/乙醇/乙二醇，有时DMSO 200uL能把小鼠杀死）稀释后，于裸鼠尾静脉注射200μL（浓度0.5 mg/mL），用量和时间需要客户根据自己的仪器和药物试剂等条件优化。每5min记录1 张动物在体内发射荧光的成像图片，分析荧光药物的分布情况。对照鼠不注射药物，进行同时记录。记录结束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器，进行成像。
（3） Cy7 检测时激发波长700～770 nm 带通，发射波长790 nm 长通。液晶可调谐滤光片扫描范围 780～950 nm，扫描步进10 nm。曝光时间为500 ms。不同的药物代谢时间不一样，注射入裸鼠体内，荧光立即分布全身，然后逐步向膀胱聚集，呈现显著的肾排泄的特点一般4～6 小时，快的只有30 分钟；如果是骨骼和鼻腔等部位靶点的Cy7 标记药物，有客户反映一周后活体成像系统仍能检测到荧光成像。器官切片观察：将解剖的器官迅速放置于4%多聚甲醛固定4 小时以上，0%，20%，30%PBS 蔗糖依次沉底，20μm 切片，多聚赖氨酸洗过的载玻片贴片，晾干，DAPI 染色。共聚焦显微镜观察，激光器为氦氖 633 nm。
2、荧光成像常见问题
（1） 什么类型的小鼠适合活体成像？
毛发对光有散射，建议用裸鼠。
（2） 给裸鼠注射的恰当和zui大注射试剂体积？
试剂的体积用量根据所采取的方式不同而不同，下面是体重25g 的裸鼠注射量。
（3） 注射针头的尺寸是多少？
推荐使用具有固定针头的28～32 号结核菌素或胰岛素注射器（0.3 或1mL）
（4） 肿瘤成像需要注射多大剂量的标记抗体？
推荐起始用量50μg 来优化用量。
（5） 未标记的染料在老鼠体内如何代谢？
未标记水溶性染料通过膀胱排泄，静脉注射后zui快能在3min 检测到膀胱内的荧光信号。
（6） 注射后多长时间开始成像？
成像时间和成像持续时间与注射试剂有关。血管示踪剂注射后马上即可成像并持续成像数小
时。注射标记的抗体IgG 到达靶点需要数小时，而后才成像并持续成像数天。
（7） Solar Fluor dyes 的荧光寿命是多少？
Solar Fluor 647 在20°C 水中τ＝1 ns
Solar Fluor 680 在20°C 水中τ＝1.2 ns
Solar Fluor 750 在20°C 水中τ＝0.7 ns
稳定性与储存：
未开封的粉末在避光干燥-20℃存放12月。CyDye NHS水溶液现配现用不能储存。任何溶解后的CyDye NHS粉末立即使用；无水的DMSO溶液-20°C保存zui多2个星期。
电 话 (e)：请点击展台进入查看
()：请点击展台进入查看
手机（Mobel)：请点击展台进入查看
菁染料产品：
Cyanine3 alkyne
Cy3 alkyne
Cyanine3 azide
Cy3 azide
Cy3 N3
Cyanine3 carboxylic acid 1144107-76-5
Cy3 carboxylic acid
Cyanine3 hydrazide
Cyanine3 maleimide
Cy3 maleimide
Cyanine3 NHS ester 1032678-38-8
Cy3 NHS ester
Cyanine3.5 azide
Cyanine3.5 carboxylic acid 1144107-79-8
Cyanine3.5 NHS ester
Cy3.5 NHS ester
Cyanine5 alkyne
Cyanine5 amine
Cy5 amine
Cy5 NH2
Cyanine5 azide
Cy5 N3
Cyanine5 Boc-hydrazide
Cyanine5 carboxylic acid
Cyanine5 hydrazide
Cyanine5 maleimide
Cy5 maleimide
Cyanine5 NHS ester 1032678-42-4
Cy5 NHS ester
Cyanine5.5 alkyne
Cyanine5.5 azide
Cyanine5.5 carboxylic acid 1144107-80-1
Cyanine5.5 maleimide
Cyanine5.5 NHS ester
Cyanine7 amine 1650635-41-8
Cy7 amine
Cy7 NH2
Cyanine7 azide
Cy7 azide
Cyanine7 carboxylic acid
Cyanine7 maleimide
Cy7 maleimide
Cyanine7 NHS ester
Cy7 NHS ester
Cyanine7.5 amine
Cyanine7.5 azide
Cyanine7.5 carboxylic acid 1686147-68-1
Cyanine7.5 maleimide
Cyanine7.5 NHS ester
Sulfo-Cyanine 5 NHS ester
Sulfo-Cy 5 NHS ester
Sulfo-Cyanine3 azide
Sulfo-Cy3 azide
Sulfo-Cyanine3 carboxylic acid
Sulfo-Cyanine3 maleimide
Sulfo-Cy3 maleimide
Sulfo-Cyanine3 NHS ester
Sulfo-Cy3 NHS ester
Sulfo-Cyanine5 alkyne
Sulfo-Cyanine5 azide
Sulfo-Cy5 azide
Sulfo-Cyanine5 carboxylic acid 1121756-16-8
Sulfo-Cyanine5 maleimide
Sulfo-Cy5 maleimide
Sulfo-Cyanine7 azide
Sulfo-Cyanine7 carboxylic acid
Sulfo-Cyanine7 NHS ester
Sulfo-Cy7 NHS ester
