研究背景：

结直肠癌是全球五大致命癌症之一，在中国是第二大常见恶性肿瘤。肝转移是患者预后不良的主要原因，25%的患者初诊时已有肝转移，术后 15%-25% 因肝转移复发， 90% 的肝转移患者无法获得有效治疗， IV 期患者 5 年生存率仅 24% 。 N- 糖基化修饰在蛋白质的多种功能中起关键作用，且与恶性肿瘤转移相关，但目前关于结直肠癌肝转移相关的 N- 糖基化蛋白质组学研究较少。

研究方法：

收集14例结直肠癌肝转移患者的原发性病灶和配对肝转移病灶样本，经处理后进行液相色谱 - 质谱（ LC-MS ）分析。对多种细胞系进行培养，构建 CTSD 突变体，通过转染、感染等操作，进行细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等实验。构建裸鼠皮下肿瘤和肝转移模型，观察肿瘤生长和转移情况。

主要研究结果：

1.CRC患者肝转移性病变表现出比原发性病变更高的 CTSD N- 糖基化水平

通过质谱技术，研究人员对比了14例原发性病灶和 14 例配对肝转移病灶的 N- 糖基化修饰差异，共检测到 139 种 N- 糖基化蛋白、 185 个 N - 糖基化修饰位点、 490 个完整结构的 N- 糖肽以及 71 种糖基。其中 46 个 N- 糖基化修饰位点此前未被 Uniprot 平台报道。在肝转移病灶中，有 13 个位点的 N- 糖基化修饰水平变化超过 1.5 倍。 N- 糖基化位点周围的氨基酸序列具有一定保守性。 44.94% 的 N- 糖基化位点被单一、固定的糖基修饰， 20.86% 的 N- 糖蛋白含有多个 N- 糖基化修饰位点。借助 GO 和 KEGG 分析发现，这些 N- 糖基化蛋白可能属于分泌蛋白和膜蛋白。在生物学过程方面，主要参与细胞间粘附、蛋白水解和免疫反应等；分子功能则主要与结合活性相关。 KEGG 通路富集分析表明，它们可能涉及溶酶体、细胞外基质 - 受体相互作用以及药物 - 受体等相关途径。此外，在  Cathepsin D （ CTSD ）的第 263 位残基处，发现  2488.06545 （ PrecursorMH ）作为 H (6) N (2) 糖基的结构修饰，在肝转移病灶相对于原发性病灶的修饰变化倍数绝对值最高。同时， H (5) N (2) 和 H (7) N (2) 的  N- 糖基化修饰水平在肝转移病灶中也显著增加，这表明肝转移病灶中 CTSD 第 263 位残基的 N- 糖基化修饰水平整体高于原发性病灶。

图1结直肠癌原发性病灶和配对肝转移病灶中 N - 糖基化蛋白的相关分析

2. CTSD糖基化修饰特征及相关位点突变对蛋白的影响

对5例 CRC 患者的原发性病灶和配对肝转移病灶进行检测，发现肝转移病灶中 CTSD 的 N - 糖基化水平高于原发性病灶。同时，在多种 CRC 细胞系中评估 CTSD 的糖基化水平， CTSD 在不同 CRC 细胞系中的糖基化水平存在差异。使用 PNGase F 和衣霉素处理细胞系后， CTSD 的分子量下降，表明 CTSD 存在 N- 糖基化修饰，且经处理后从糖基化形式转变为非糖基化形式。分析发现 CTSD 在天冬酰胺残基  263 （ N263 ）处具有进化保守性。 UniProt 蛋白数据库预测 CTSD 有 2 个潜在 N- 糖基化位点（天冬氨酸残基 134 和 263 ）。随后在 SW480 和  SW620 细胞系中沉默内源性 CTSD 表达，再分别转导编码野生型  CTSD （ CTSD WT ）或突变型 CTSD （ CTSD N263Q 、 CTSD N134Q/N263Q ）的外源质粒，成功构建稳定表达细胞模型。通过对比突变前后及经 PNGase F 处理的 CTSD 分子量变化，确定 CTSD 仅在残基  134 和 263 处存在 N- 糖基化修饰位点。

图 2 CTSD N- 糖基化修饰位点验证

3.CTSD N263位点糖基化修饰促进CRC生长和转移

将CTSD野生型（ WT ）和 N263Q 突变型（非糖基化）的 SW480 细胞分别皮下注射至裸鼠，成瘤实验的结果表明 CTSD WT 组肿瘤体积显著大于 N263Q 组，且肿瘤外观更明显、重量更重。在肝转移裸鼠模型中， WT 组裸鼠肝脏表面可见明显转移结节，而 N263Q 组肝脏无肉眼可见转移灶； HE 染色显示 WT 组肝脏存在典型转移灶， N263Q 组肝脏组织正常，无转移迹象，表明 CTSD 在 N263 位点的 N - 糖基化修饰是其促进 CRC 生长和肝转移的关键因素，缺失该修饰（ N263Q 突变）会导致肿瘤增殖能力下降、皮下肿瘤生长速度显著减慢、转移潜能丧失。

图3 CTSD N263位点糖基化修饰位点验证对 CRC 生长和转移的影响

4.CTSD N-糖基化修饰对其细胞定位、稳定性及功能活性的影响

GeneCards显示 CTSD 主要分布于细胞外基质、溶酶体和内体。免疫荧光实验发现野生型（ WT ） CTSD 与溶酶体标记物 LAMP1 、早期内体标记物 EEA1 、晚期内体标记物 Rab7 共定位，表明其正常运输至溶酶体和内体；而突变体（ N263Q 、 N134Q/N263Q ） CTSD 丧失与上述标记物的共定位能力，滞留于细胞质或错误定位。单突变体（ N263Q ） CTSD 分泌量显著低于 WT 细胞，提示 N263 糖基化缺失抑制其分泌；而双突变体（ N134Q/N263Q ） CTSD 分泌量反而高于 WT 细胞，表明双位点糖基化缺失可能解除某种分泌抑制机制。环己酰亚 an （CHX）追踪显示 WT CTSD 在处理 5 小时后仍保持较高水平，半衰期较长， N263Q 突变体 CTSD 在处理 3 小时后显著降解，半衰期缩短。使用 CTSD 特异性底物（ GKPILFFRLK (Dnp)-D-R-NH2 ）和荧光法检测发现， WT CTSD 的酶活性显著高于 N263Q 和 N134Q/N263Q 突变体，双突变体酶活性低，单突变体次之，表明糖基化位点数量与酶活性呈正相关。这表明 N263 糖基化是 CTSD 进入溶酶体 / 内体的必要条件，确保其在酸性环境中发挥功能，糖基化抑制蛋白降解，延长 CTSD 的半衰期，并直接影响 CTSD 的催化效率，促进其蛋白酶功能。此外， N263 位点在定位和稳定性调控中起主导作用，而 N134 可能通过协同作用影响分泌和酶活。

图4 CTSD第 134 和 263 位的 N- 糖基化调节其折叠位置、稳定性和功能活性

5. CTSD N-糖基化修饰的调控机制研究

随后探究了 CTSD的 N- 糖基化修饰的调控机制，重点鉴定了参与其糖基化的转移酶复合体及关键亚基。利用 FLAG 标签富集 CTSD 野生型（ WT ）和 N263Q 突变体的互作蛋白，通过质谱分析差异结合蛋白，发现 CTSD WT 特异性结合 235 种蛋白， N263Q 结合 191 种蛋白，其中 45 种蛋白仅与 WT 互作，其中 DDOST 是 N - 糖基转移酶。 N - 糖基化起始于内质网中的寡糖转移酶（ OST ）复合体，分为 OST-A （催化亚基  STT3A ）和 OST-B （催化亚基 STT3B ），非催化亚基如 DDOST 可稳定复合体与底物的结合。随后，通过 CPTAC 数据库分析发现， STT3A 、 STT3B 和 DDOST 在结肠癌组织中均显著高表达，提示其与 CRC 进展相关。在 SW480 细胞中敲除 STT3B 或 DDOST 后， CTSD 分子量显著降低，表明 N- 糖基化修饰缺失；而敲除 STT3A 无明显变化。免疫共沉淀验证发现， CTSD WT 与 STT3B 、 DDOST 显著互作，而 N263Q 突变体与两者的结合能力明显减弱， CTSD 与 STT3A 无明显结合，表明 STT3B 是主要催化亚基。此外，免疫荧光共定位的结果表明 CTSD 与 STT3B 、 DDOST 在细胞质和内质网区域显著共定位，而与 STT3A 无共定位。

图5 CTSD N-糖基转移酶鉴定

6. CTSD的 N- 糖基化修饰通过降解 ACADM 、调控铁死亡促进 CRC 肝转移的分子机制

通过比较CTSD野生型（ WT ）和 N263Q 突变型 SW480 细胞的蛋白质组，筛选鉴定出 391 个差异表达蛋白（ DEPs ），其中 WT 中高表达的蛋白主要富集于蛋白酶活性、细胞迁移等通路， N263Q 中高表达的蛋白涉及脂肪酸代谢、抗氧化反应等，通过 CTSD WT 特异性互作蛋白与 DEPs 的交集分析，初步筛选出 8 个候选分子： ACADM 、 PRDX3 、 ALDH2 、 EHHADH 、 DHCR7 、 TGFB1I1 、 IDH2 、 ALDH1A1 。临床相关性分析显示， ACADM 和 PRDX3 高表达患者的预后显著优于低表达者，提示两者可能为抑癌因子； TNM 分期分析发现 ACADM 表达随 CRC 恶性程度（ TNM 分期）进展而降低，在肝转移（ IV 期）患者中表达低，表明  ACADM 与转移负相关，因此选为后续研究靶点。在 CTSD WT 和 N263Q 细胞中， CTSD 表达水平相当，但 N263Q 细胞的 ACADM 蛋白水平显著升高，提示 CTSD 糖基化促进  ACADM 降解。此外， Co-IP 的结果表明 CTSD WT 与 ACADM 显著结合，而 N263Q 突变体无法与  ACADM 互作，表明 CTSD 的 N263 糖基化是其结合并降解 ACADM 的前提。最后，在 90 例 CRC 组织中， CTSD 表达与 ACADM 呈显著负相关，且两者在细胞质中共定位，进一步验证  CTSD 对  ACADM 的降解作用在临床样本中普遍存在。

图6 CTSD N263-糖基化修饰影响 CTSD 蛋白酶对 ACADM 的蛋白水解作用

研究结论：

本研究聚焦结直肠癌肝转移中N-糖基化修饰机制， CTSD 的 N263 位点糖基化在肝转移灶中显著上调，该修饰由 STT3B 和 DDOST 糖基转移酶复合体调控。 CTSD 糖基化通过维持其溶酶体定位、稳定性及蛋白酶活性，促进降解 ACADM 蛋白，进而调控铁死亡相关蛋白（ ACSL4 、 SLC7A11 、 GPX4 ），增强 CRC 细胞侵袭转移能力。体内实验显示，敲除 N263 糖基化可抑制裸鼠肿瘤生长及肝转移。该研究揭示 CTSD-N263 糖基化通过 “STT3B/DDOST-ACADM- 铁死亡轴 " 驱动转移，为 CRC 治疗提供了新靶点与理论依据。

研究思维导图：

参考文献：

Xiong N, Du Y, Huang C, Yan Q, Zhao L, Yang C, Sun Q, Gao Z, Wang C, Zhan J, Zhang H, Wang S, Ye Y, Li Y, Shen Z. N-glycosylation Modification of CTSD Affects Liver Metastases in Colorectal Cancer. Adv Sci (Weinh). 2025 Feb;12(7): e2411740. doi: 10.1002/advs.202411740. Epub 2024 Dec 24. PMID: 39716927; PMCID: PMC11831497.