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定量蛋白质组学之SILAC技术
点击次数：511 发布时间：2013-4-7
定量蛋白质组学之SILAC技术
Super-SILAC
因组织样品的复杂度以及代谢标记在非增殖细胞上的限制，组织蛋白质组学面临了很大挑战。之前，研究人员使用SILAC标记的细胞作为“spike-in”对照，解决了标记问题，因为通过与对照比较，可进行每种组织样品的定量。日本科学家曾将标记的Neuro2A细胞裂解液加入小鼠的脑组织裂解液中，开展小鼠脑组织的定量蛋白质组研究。
然而，考虑到组织的复杂度，以单个细胞系来代表组织似乎是不够的。此外，若样品是多样性的，如肿瘤样品，则单个细胞系也无法代表这种多样性。为了克服这些挑战，Matthias Mann教授及其同事将多个SILAC标记的细胞系混合在一起，作为“spike-in”对照，这就是Super-SILAC（超级SILAC）。
他们将多个过去建立的癌症细胞系中的标记蛋白裂解液混合，这样就复杂度而言，它们比单个细胞系更为全面，从而增加了准确性。为了代表更宽范围的特定肿瘤类型，他们选择了不同来源、不同阶段，且携带各种分子标记物的细胞系，并将等量的标记蛋白混合成超级SILAC混合物（super-SILAC mix）。随后将这些标记蛋白裂解液以1：1的比例与每种组织样品混合，裂解液充当了组织比较的内部标准。
在乳腺癌组织的研究中，Mann及其同事通过标记四种乳腺癌细胞系，外加一种正常的乳腺上皮细胞类型，以1：1：1：1：1的比例将蛋白裂解液混合，获得了完整的SILAC-标记蛋白。他们比较了小叶和导管乳腺肿瘤中与转变过程、*敏感性和药物抗性相关的低丰度蛋白。
这种新方法有潜力将相对蛋白质组定量方法扩展到肿瘤生物学研究的分子方面，并可能成为探索候选生物标记物的工具。SILAC与其他相对定量的质谱技术相比，优势在于灵敏度高、定量准确，且实验误差很小，因为样品在实验流程的早期就已混合。此外，超级SILAC方法还有可能成为了解癌症分子机制的宝贵工具。
开展SILAC研究的工具
赛默飞世尔（Thermo Fisher Scientific）在收购HyClone和Pierce之后，在SILAC方面的产品线还是相当丰富的。除了经典的SILAC培养基（RPMI-1640和DMEM）外，赛默飞世尔近年来也推出了不少新产品。
SILAC培养基 & 血清
所有的SILAC培养基都不含有L-赖氨酸和L-*。对于经典的RPMI-1640和DMEM，赛默飞世尔提供了液体（500mL）和粉剂（可配成10L）的包装。除此之外，它还有专门用于SILAC的MEM、DMEM:F12、F12、IMDM、McCoy’s 等培养基。当然，这些还不够。为了满足干细胞研究的需求，它还推出了用于SILAC的小鼠干细胞扩增DMEM，低渗透压小鼠干细胞DMEM。而无酚红MEM培养基适用于易受雌激素刺激的细胞，如乳腺癌细胞系MCF7，而不会产生人为的雌激素反应。此外，赛默飞世尔还提供透析过的FBS、干细胞的透析FBS以及血清替代物。
重型 & 轻型氨基酸
赛默飞世尔还单独提供了同位素标记的氨基酸，可与上面提到的缺陷型培养基共同使用。重型和轻型L-赖氨酸和L-*是SILAC分析中zui常用的氨基酸。利用氨基酸的不同同位素，可轻松分析三种不同的实验条件。以赖氨酸为例，4,4,5,5-D4 L-赖氨酸和13C6 15N4标记的L-赖氨酸与轻型赖氨酸相比分别有4-和8-Da的分子量变化。而13C6 L-*和13C6 15N4 L-*则分别比轻型*的分子量高了6-和10-Da。L-*也是SILAC中很常用的氨基酸。此外，赛默飞世尔还提供了L-*作为培养基添加剂，以防止同位素标记的*代谢转换成*。
SILAC实验流程
据赛默飞世尔介绍，SILAC流程如下：利用含有0.1毫克/毫升的重13C6 L-赖氨酸-2HCl或轻L-赖氨酸-HCl，并且在含有10%透析过的FBS的SILAC DMEM培养基上培养A549细胞，培养六代（10天）。在*标记后，利用5 μM*处理13C6 L-赖氨酸标记的细胞24小时。利用Thermo Scientific M-PER哺乳动物细胞总蛋白抽提试剂裂解来自每种样品（轻和重）的细胞。将样品按照使用Thermo Scientific BCA蛋白定量试剂测定的蛋白浓度进行标准化，然后从每种样品中取50毫克并混匀，此后利用4-20%的SDS-PAGE分析样品。利用Thermo Scientific GelCode蓝色染色试剂对凝胶进行染色，再利用Thermo Scientific 胶内*消化试剂盒对蛋白进行消化和烷基化，zui后利用LTQ Orbitrap杂交质谱进行分析。