男女呻吟久久免费视频 士锋生物细胞裂解实验方法总结

 裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法，通常会很少使DNA 断裂。这两种方法（包括SDS 和处理等）提取纯化DNA中常用的方法。机械裂解可以更均一的裂解细胞，同化学裂解相比，机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞，但也会造成DNA 的断裂。

一、机械裂解法主要有以下两中：

1.热休克（Thermal shock），既反复冻溶法，是一种常用的机械裂解方式比，通常由冷冻和解冻两部分组成（freezing and thawing），。原理：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行，解冻可以在37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和，但是很有效，有资料表明用热休克和与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。

2.超声波处理（Ultrasonication）既利用超声加热的方法，把细胞破碎。但这种处理会导致DNA 的断裂，所以加热不宜过剧烈，要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。bead-beating 也是常用的机械处理方式，有报道指出bead-beating 比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好 虽然DNA产量较高，但通常得到的dna片段较小。

二、 化学裂解和酶裂解法（在提核酸时联合使用）

主要是裂解液处理法，细胞裂解液的主要目的有以下几种：（1）利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性。

主要根据不同的目的，裂解液的组成有所不同，主要有提取核酸和蛋白两中。在提取RNA或DNA时，我们主要是要充分裂解细胞，得到更多的核酸；如果我们的目的是蛋白，那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液，在提取蛋白后，再根据实验需要复性蛋白等。以下是细胞裂解中常用试剂和其作用：

50 mM Tris-HCl pH 7.4（缓冲体系），150 mM NaCl（等渗体系），1 mM PMSF （强大的蛋白酶抑制剂），1 mM EDTA（变性剂和稳定剂），5 µg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂），5 µg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂），1% Triton x-100（破坏细胞），1% Sodium deoxycholate（中度变性剂和蛋白溶解剂），0.1% SDS（强变性剂和蛋白溶解剂）。7M 尿素，2M硫脲（可以提高膜蛋白的融解），蛋白酶K等。

细胞裂解时间把握问题：孔板里细胞用PBS洗2次后，加入细胞裂解液，然后去测总蛋白含量和酶的活力，不知道细胞要裂解到什么程度?

答：因为所用的细胞类型不一样，所以实验的条件也需要摸索，建议这样来做：加入细胞裂解液后，不同时间取样，以时间和总蛋白含量和酶的活力作曲线，这样就可以找到裂解的*时间，仅供参考。

原核表达的细胞裂解问题：做原核表达，用BL21表达，之后如何裂解细胞才行呢?我的菌液只有300微升，说明书上用超声裂解细胞，但没给出具体做法，我们这只有大的探头，不好做，有什么好的办法么?

要是用超声裂解，要怎么做才行?我是超声15s间隔10s座4次。裂解不好，应该怎样改呀?!

答：请试一试IFCC法：

1 收集细胞悬液

2 40C 低温离心（3000rpm，5min）

3 弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，

370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液

Western Blot细胞裂解方法个人小结：

过些天准备做western blot，昨天就提前把细胞裂解了，提出蛋白来保存。一下是我做的方法，大家参考，可能有不正确的地方，希望大家指出来，谢谢!

1。取一瓶细胞（100ml的瓶子），PBS洗2次，消化，加入10ml 培养液，制备成细胞悬液；

2。将细胞悬液移入10ml离心管中，4。C，2500rpm，离心5min；

3。弃上清，加入预冷的PBS（即4。C存放的PBS）于离心管中，吹打，4。C，2500rpm，离心5min；弃上清，重复上述步骤一次；共洗细胞2次，充分洗掉培养液；

4。弃上清，加入200ul细胞裂解液（每1ml裂解液中加入10ulPMSF），置于冰上，裂解40min～1h；裂解过程中可用枪头吹打或间断摇动离心管，以使蛋白充分裂解；

5。取出离心管，于4。C，12000rpm，离心5min；

6。将上清移入EP管中，-20。C保存，即可。

注：本来应该在培养瓶或培养皿中裂解，但出于某种原因，我为节约细胞裂解液，故试着在离心管中裂解，不知道这样裂解是否充分。但我想这种方法也是可以考虑的。

核蛋白裂解液配方与步骤：

核蛋白裂解液配方

Buffer A

10 mM HEPES

1.5 mM MgCl2

10 mM KCl

0.5 mM DTT，

0.05% NP40 （or 0.05% Igepal or Tergitol） pH 7.9

Buffer B

5 mM HEPES

1.5 mM MgCl2

0.2 mM EDTA

0.5 mM DTT

26% glycerol （v/v）， pH 7.9

核蛋白裂解操作步骤

Method

1. Prepare 1 ml of buffer A with added cocktail of usual inhibitors from frozen stock and store on ice.

2. Add 500 μl of buffer a per large petri dish on ice and scrape thoroughly， leave on ice for 10 min.

3. Centrifuge at 4°C at 3000 rpm for 10 min.

4. Remove supernatant and keep it （this will contain everything except large plasma membrane pieces，

DNA， nucleoli）， extract out 10 μl for Bradford assay.

5. On ice resuspend pellet in 374 μl of buffer B and add 26 μl of 4.6 M NaCl to give 300mM NaCl （high salt

helps lyse membranes and forces DNA into solution）.

6. Homogenize with 20 full strokes in Dounce or glass homogenizer on ice.

7. Leave on ice for 30 min.

8. Centrifuge at 24，000 g for 20 min at 4°C.

9. Aliquot supernatant， remove 10 μl for Bradford assay and store at -70°C.