牛牛天天人人综合影院 士锋生物PCR反应条件的调节

1、 温度与时间的设置：

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq dna酶仍有较高的催化活性)。

1. 变性温度与时间：变性温度低，解链不*是导致PCR失败的zui主要原因。DNA在其链分解温度时的变性只需几秒钟,但反应管内达到Tss还需一定时间,变性温度太高会影响酶活性;通常情况下93℃～94℃1min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。变性所需的加热温度取决于模板及PCR产物双链DNA中的G+C含量。双链DNA中的G+C的比率越高，则双链DNA分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与DNA分子的长度相关，DNA分子越长，在特定的变性温度下使双链DNA分子*分离所需的时间就越长。若变性温度太低或变性时间太短，则只能使DNA模板中富含AT的区域产生变性，当PCR循环中的反应温度降低时，部分变性的DNA模板又重新结合成双链DNA，从而导致PCR的失败。

2. 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。复性温度决定着PCR的特异性.引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s，足以使引物与模板之间*结合。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择zui适退火温度的起点较为理想。如果(G C)低于50%，退火温度应低于55℃。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃)

【引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G C)×4℃ (A T)×2℃计算退火温度】:

较高的退火温度可提高反应的特异性。在Tm值允许范围内，应尽量选择较高的复性温度。

3. 延伸温度与时间：Taq dna聚合酶的生物学活性：70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子;70℃ 60核苷酸/S/酶分子;55℃ 24核苷酸/S/酶分子;高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。

延伸温度应在Taq酶的zui适温度范围之内，一般在70～75℃。常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。3～4kb的靶序列需3～4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

2、 循环数：

循环次数决定着扩增的程度。在其它参数都已优化的前提下，循环次数取决于zui初靶分子的浓度。循环次数过多会增加非特异性产物量及碱基错配数，此外还会导致PCR反应“平台效应”的出现;循环数太少会影响正常的PCR产物量。常规PCR一般为25-40周期较合适，具体要多少循环数可通过预试验确定。在其他参数交已优化的条件下，zui适循环数取决于靶序列的初始浓度，模板DNA分子数 需要热循环次数参照：

3.0×105 25-30

1.5×104 30-35

1.0×103 35-40

50 40-45

3、 PCR产物积累规律：

反应初期产物以2n呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡，产物进入一个缓慢增长时期(“停滞效应”)，即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关.