女人天天干夜夜爽视频 如何进行DNA序列测定技术

序列测定的技术和策略
Sanger双脱氧链终止法
Maxam－Gilbert DNA化学降解法
测序策略

目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。然后在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道这上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。

一、Sanger双脱氧链终止法[点击查看详情]

二、Maxam－Gilbert DNA化学降解法

与包括合成反应的链终止技术不同，Maxam-Gilbert法要对原DNA进行化学降解。这一方法是在体外研究lac阻抑制与lac操纵基因相互作用时酝酿发展起来的。时至今日，可以探测DNA构象的蛋白质－DNA相到作用，仍然是Maxam- Gilbert法*的鲜明特点。在这一方法（Maxam和Gilbert，1980）中，一个末端标记的DNA片段在5组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某于种或某一类碱基。因此生成5组放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。相对而言，Maxam-Gilbert法自初次提出以来，基本没有变化。虽然设计了另一些化学降解反应（见综述：Ambrose和Pless，1987），但这些反应一般只作为Maxam和Gilbert(1977，1980)zui早提出的反应的补充。这一方法的成败，*取决于上述这些佞两步进行的降解反应的特异性。*步先对特定碱基（或特定类型的碱基）进行化学修饰，而第二步修饰碱基从糖环上脱落，修饰碱基5"和3"的磷酸二酯链断裂。在每种情况下，这些反应都要在精心控制的条件下进行，以确保每一个DNA分子平均只有一个靶碱基被修饰。随后用哌啶裂解修饰碱基的5"和3"位置，得到一组长度从一到数百个核苷酸不等的末端标记分子。比较G、A＋G、C＋T、C和A>C各个泳道， 右从测序凝胶的放射自显影片上读出DNA序列。由于种种原因（如采用32P进行放射性标记、末端标记DNA的比活度、裂解位点的统计学分布、凝胶技术方面的局限性等等），Maxam-Gilber法所能测定的长充要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果*。在70年代Maxam-Gilbert法和Sanger法刚刚问世时，利用化学降解进行测序不但重现性更高，而且也容易为普通研究人员所掌握。Sanger 法南非要单链模板和特异寡核苷酸的，并需获得大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow 片段的高质量酶制剂，而Maxam-Gilbert法只需要人所共的简单化学试剂。但随着M13 噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。然而，化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成所产生的拷贝。因此，利用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，不可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。然而，由于Sanger法既简便又快速，因此是现今的*选择方案。事实上，目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的。 类核苷酸类惟物的耐受性看来也优于原来的测序酶。