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女人天天干夜夜爽视频 士锋cDNA的合成

时间:2015/11/19阅读:1003
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一 原理
逆转录PCR (RT-PCR) 具有灵敏度高、专一性好、简便快捷等优点,其不仅是定量检测微量样品和表达水平低的基因的一种有效方法,同时也是从真核生物中获得目的基因的一条重要途径。
cDNA的合成是RT-PCR的重要环节。以mRNA为模板,在逆转录酶的催化下,随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA(complementary DNA,cDNA),再按照普通PCR的方法用两条引物以cDNA为模板,则可扩增出不含内含子的可编码完整基因的序列。
不同mRNA拷贝成cDNA的效率不同;因此,适合于一种mRNA拷贝的条件可能对另一种mRNA不适合。一般来说,从事不均一mRMA群体时,所使用的条件是导致cDNA合成的终产量达到zui大,下述参数十分重要。
1.逆转录酶 有两种不同的逆转录酶可以催化以mRNA为模板,oligo(dT)作为引物,合成与mRNA互补的cDNA链。一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV),由两条肽链组成,具有聚合酶活性和很强的rna酶H活性,它zui适温度是42℃,zui适pH8.3。在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍,然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA产生也限制其长度。另外,禽源逆转录酶制剂可被能切割DNA的核酸内切酶污染。另一种来源于鼠白血病病毒(Mo-MLV),是单肽链的,有RNA聚合酶活性和相对较弱的RNA酶H活性,zui适温度37℃,zui适pH7.6,较弱的RNA酶H活性对获得2-3kb的mRNA的全长cDNA有很大好处。在*链反应前可用氢氧化甲基汞处理,破坏mRNA的二级结构,这一步对于zui适反应温度较低(37)℃的鼠源逆转录酶催化的反应可能更为重要。临合成cDNA*链之前加入过量的巯基试剂,可以使氢氧化甲基汞从RNA上解离。
2.单价阳离子 离子条件基本上影响各种模板的转录效率。用钾比用钠离子可获得较长的转录产物。对于cDNA长度的zui适钾离子浓度为140-150mM。
3.二价阳离子 对于反转录酶活性来说,二价阳离子是必需的。低于4mM Mg2+未能观察到活性;产生全长转录产物的zui适浓度是6-10mM。
4.脱氧核苷三磷酸 使用四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)中每一种的高浓度对于有效合成cDNA是特别重要的。如果其中只有一种的浓度下降到10-50微摩尔以下,全长转录物的产量将明显下降。常用的dNTP的浓度为200-250微摩尔。
二.材料与方法
1 材料
RNA样品
2 仪器、用具
PCR仪、电泳仪等、0.2mlPCR管(1个)、移液器、碎冰
3 试剂
RNase Free dH2O;5×RT Buffer (含25mM Mg2+);dNTP (10mM each);RNase Inhibitor(10U/μl );Oligo (dT)20 (10μmol/L);ReverTra Ace
4 方法
(1) 以总RNA为模板,合成cDNA*链,体系如下:

(2) 反转录反应条件为:30℃ 10min,42℃ 30min ,99℃ 5min,4℃ 5min。反应结束后冰
浴5min。
注意事项:
① cDNA*链合成的反应液冰上配制。
使用ReverTra Ace、RNase Inhibitor 等酶类时,应轻轻混匀,避免起泡;由于酶保存液
中含有50%的甘油,粘度高,分取时应慢慢吸取。

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