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牛牛天天人人综合影院 关于细胞培养的一些zt

时间:2016/11/29阅读:861
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一般培养瓶、培养板、培养皿的材质都是生物相容性的聚苯乙烯,且要求具有较好的光学性能。在加工成型后,要进行组织培养处理。各公司用的方法都不太一样,而且这都是讳莫如深的商业秘密。其实不外乎两种,一种是物理方法,即使培养细胞的那个面的粗糙度适合细胞粘附生长;第二种是化学方法,用季铵盐、多肽或者血清、血浆等促进细胞粘附的物质涂覆表面。 
在重复使用培养材料的时候,无论用什么方法洗,都会破坏这层很薄的处理层,使培养材料的生物相容性变差。如果这样的话,我们冒着培养物被污染的危险,还不如使用玻璃培养瓶呢。 
我为什么使用一次性细菌培养皿呢?其实这是国内供应商对这种培养皿的一个俗称,应该从字面上翻译成“一次性使用培养皿”,也就是“Disposable Petri Dish”。这是没经过组织培养处理过的聚苯乙烯培养皿,买回后自己用聚赖氨酸、明胶、血清处理一下,灭菌后使用,效果不比细胞培养皿差,成本却低了很多。尤其向大家以色列Mini Plast公司的一次性培养皿,Φ90的才8角钱一个,质量,比国产的同样价格的强许多。 
还有,可以买比利时Orange公司的培养瓶,价格只有Coring或Nunc的60%,我使用了一年,效果不比Nunc和Coring的差,而且是经过人体工学处理的,使用起来很顺手。 
其实DMEM细胞培养基的高糖和低糖对细胞培养影响并不大,我几年前刚开始做细胞培养时也常为此困扰。如果为了保险起见,选高糖的好了。培养基中的、丙酮酸钠浓度更重要,一定注意不同货号培养基之间的细小差别,选组分全加入的货号产品,毕竟省得不少另加试剂的开销。HEPES的添加也很关键,尤其对代谢旺盛的细胞更是如此。选血清时,宁可买Hyclone公司的新生牛血清,也不要用国产胎牛血清,切记。经济情况允许,建议用Hyclone的Define级血清,效果太好了。实际上国产胎牛血清都是新生牛,基本上都是病弱新生牛未哺乳前取的血,甚至不如进口新生牛血清,价格却相差不多。国产血清太“脏”了,其中的内毒素、支原体等指标都达不到要求,zui近研究表明,内毒素是细胞凋亡的诱因之一。如果不做细胞因子和免疫相关的实验,建议血清不要灭活,灭活后严重影响细胞生长速度,且细胞贴壁率降低。 

Gibico的血清很好,我读硕士时一直用。但是zui近两年由于疯牛病的原因(Gibico的血清不都产在美国和澳洲,也有疯牛病发生的国家),进口的少,价格也贵。同一价格的前提下,毕竟Hyclone的Define级质量更好。Sigma的血清也很好,质量标准比Hyclone的还严格。具体选那种,还得根据您的工作性质而定,毕竟在国内科研经费有限,除非老板有上千万的项目,可以不计实验成本。 

关于血清浓度和是否灭活,取决于您的具体实验,并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高,我用20%,有利于提高细胞贴壁成活率,尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏,就应该加25%血清。 
如果做MTT实验或类似的四唑盐参与线粒体代谢的实验,血清浓度尽可能低一些,一般5%-10%,可以减少血清对结果的干扰,尤其是采用水溶液法(如加10%SDS盐酸溶解而不用DMSO)时更加重要。如果您做流式细胞分析,需要分析细胞周期,要经过一个“同步化”过程,有的学者用血清饥饿法,也就是24小时不加血清,使细胞周期趋于同步化。 

我的细胞传代原则:不用EDTA,只用,先用D-hank’s洗掉残留培养基和血清,然后按1ml/10cm2培养面积加入,镜下观察,待到细胞回缩明显且尚未脱壁时(这个过程不超过1分钟),倒掉大部分,只保留细胞表面被少量湿润,37度培养箱中放置5-15分钟,直至细胞可象流沙状下滑,加入含血清培养基终止消化,轻轻吹打使细胞散开,如有团块,可考虑200目筛过滤,可不洗涤离心细胞。此种方法对细胞伤害zui小,如果做流式细胞分析,也可用此法,只不过在中加入等量EDTA溶液,出来的峰极规整漂亮。 
某些细胞只用常规培养基不行,还必须补充生长因子或特殊量的氨基酸才能正常生长,要多参考相关文献。 

另外,二氧化碳张力和温度也很重要,有些细胞需要较高的二氧化碳浓度或较特殊的温度。可选用透气盖培养瓶或培养皿培养板培养。

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