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牛牛天天人人综合影院 PCR反应程序

时间:2017/8/14阅读:718
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1.常规程序 
将 PCR 反应所需的成分配置完后,在 PCR 仪上于 94-96℃ 预加热几十秒至几分钟,使模板 DNA 充分变性,然后进入扩增循环。在每一个循环中,先于 94℃ 保持 30 秒钟使模板变性,然后将温度降到复性温度(一般 50-60℃ 之间),一般保持 30 秒钟,使引物与模板充分退火;在 72℃ 保持 1 分钟(扩增 1kb 片段),使引物在模板上延伸,合成 DNA ,完成一个循环。重复这样的循环 25~35 次,使扩增的 DNA 片段大量累积。zui后,在 72℃ 保持 3-7min ,使产物延伸完整, 4℃ 保存。 

2.复性(退火)和延伸温度 
复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素,通常在 50-60℃ 之间。具体的温度主要由引物的 Tm 值决定。延伸温度绝大多数设定为 72℃ 。如果复性的温度很高,可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度,变成二步法 PCR 。 

3.反应时间 
变性步骤一般使用 30 秒钟,如果模板的 G+C 含量较高,或直接用细胞做模板,变性时间可适当延长。复性时间有 30 秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定,一般采用 1kb 用 1 分钟来保证充足的时间。 

4.循环次数 
循环次数主要与模板的起始数量有关,在模板拷贝数为 104~105 数量级时,循环数通常为 25~35 次。 
平台效应(plateau effect):PCR 扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因:底物和引物的浓度已经降低,dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低 ,产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用,非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用,扩增产物自身复性,高浓度扩增产物变性不*。 

5.PCR 反应液的配制 
pcr反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样,在zui后加入 DNA 聚合酶。早期的 PCR 仪没有带加热的盖子,要求在反应液上覆盖一层矿物油,防止水分蒸发。 
对于使用具 3’-5’ 外切活性的高温 DNA 聚合酶时,有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时,如果将反应成分分开配制,A 管含模板、引物和 dNTP ,以及调整体积的 H2O , B 管含缓冲液、DNA 聚合酶和水,然后再将两管溶液混合起来,可较好地克服这个问题。 
按照常规的方法配制反应体系,有时会出现非特异性扩增的问题。热启动(hot start)PCR操作方式可较好解决这一问题。将 dNTP 、缓冲液, Mg2+和 primer 先配制好,然后加入一粒蜡珠(如 Ampli Wax PCR Qam100),加热熔化,再冷却,使蜡将溶液封住,zui后加入模板和 DNA 聚合酶等剩余成分。只有

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