牛牛天天人人综合影院士锋生物猪瘟单克隆抗体ELISA方法试验介绍

时间：2014-1-2阅读：748

（一）材料及试剂
1．猪瘟单抗纯化抗原
2．兔抗猪IgG酶标抗体
3．猪瘟阳性血清
4．猪瘟阴性血清
1～4均由的生物制品所购买。
5．elisa反应板
6．包被液
碳酸钠 1.50g
2.93g
H2O加至 1 000ml
pH值9.6
7．PBS液
氯化钠 8.90g
磷酸二氢钾 0.20g
无水 2.13g
加双馏水 1 000ml
8．PBS－吐温洗涤液
PBS液 1 000ml
犊牛血清 5ml
混合即可
9．底物溶液
⑴ 0.1Mol/L柠檬酸液
柠檬酸 21g
双蒸馏水加至 1 000ml
⑵ 0.2Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O 71.6g
双蒸馏水加至 1 000ml
⑶ pH5.0磷酸盐－柠檬酸缓冲液
取⑴液 24.30ml
⑵液 25.70ml
混匀即可
⑷邻苯二胺液
取⑶液 50ml
双馏水 50ml
磷苯二胺 20mg
30%H2O2 0.15ml
待邻苯二胺溶化后再加H2O2，现用现配。
10．终止液
浓H2SO4(98%) 22.2ml
H2O 177.80ml
（二）操作方法
1．用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各做100倍稀释，每孔包被100µl，4℃湿盒过夜。
2．次日取出，甩去孔内液体，3×3′冲洗。
3．将待检血清以PBS液做400倍稀释，每孔加100µl同时将猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清各做100倍稀释，于对照孔中加100μl。37℃温育1.5h～2h。
4．重复第二步，取出，甩去孔内液体，3×3′洗涤。
5．将兔抗猪IgG酶标抗体以PBS液做100倍稀释，每孔加100μl，37℃温育1.5h～2h。
6．重复第4步。
7．每孔加底物溶液100µl，室温下观察显色反应。当阴性对照孔稍显色时，立即终止反应，并以阴性孔做空白对照。
8．每孔加终止液50µl立即于酶联免疫吸附检测仪测定490nm波长的光密度。
（三）结果判定
在猪瘟弱毒酶联板上，OD≥0.2，为猪瘟弱毒抗体阳性；OD＜0.2，为猪瘟弱毒抗体阴性。
在猪瘟强毒酶联板上，OD≥0.5，为猪瘟强毒抗体阳性；OD＜0.2，为猪瘟强毒抗体阴性。

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