男女呻吟久久免费视频 RAPD技术应用中的一些问题及对策

摘要：综述了RAPD技术的一些理论性问题，包括RAPD与其它分子标记技术相比的优点，影响结果重复性的因素，显性标记产生的原因，条带取舍的标准等。提出在实验中解决这些问题的一些方法：严格控制反应条件，采用单倍体和单剂量标记，系统学研究中要结合其它方法进行分析，定位基因时要选用合适的群体等。

1.RAPD技术原理及特点

1．1原理RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA），即随机扩增多态性DNA技术，是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PCR。它的应用是基于这样的一个推理：对于同一模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。

90年代前期RAPD技术得到广泛的应用，几乎所有的作物都有这方面的研究报告。但随着研究的深入，人们发现该技术存在一定的缺陷，并对此作了一些探索。本文仅就RAPD技术的原理和应用中存在的理论性问题及一些改进措施的研究作一综述。

1.2RPAD特点与PCR相比，具有以下几个特点：

与RFLP相比，具有以下特点：
①RAPD分析只需要少量模板，一次扩增仅需20－100ng，这对于DNA量很少的材料进行基因组分析有利。比如对花粉粒、原生质体、种子等的DNA分析是切实可行的。
②RAPD标记具有更大的随机性，亦有利于图谱的构建。对于DNA含量大的和多倍体物种，RFLP探针会与多倍体的多个片段杂交，所得到的混合指纹会对其它等位基因的阐明带来困难。而且由于DNA量较大，进行单拷贝的southern杂交不很实际，至少需要很长的曝光时间，并且已知的探针数量有限。RAPD大大增加了可构建遗传图谱物种的数量。
③无需借助于有伤害性的同位素，耗费的人力物力少。
④灵敏度高。引物中的个别碱基的变化会引起扩增条带和强度的剧烈变化，这是RFLP所*的。
⑤RAPD标记可以覆盖整个基因组，包括编码和非编码区，可以反映整个基因组的变化。
⑥RAPD产物有大于50％的条带扩增于单拷贝区，经过克隆和序列分析后，可作为RFLP和原位杂交的探针，在基因定位、克隆及辅助选择育种中可以广泛应用。

2.RAPD技术本身存在的问题及对策

RAPD技术是由多种成分参加的生化反应，反应中各种成分均为微量，尽管其反应灵敏度高，但是影响因素较多，会出现重复性差等一些问题。为了得到较稳定的结果，各种反应参数必须事先优化选择，操作中每一步都必须小心谨慎，以防止出现差错。

2．1温度RAPD一般反应条件是：变性92－95℃，常用94℃，30－60s；延伸72℃，60－120s；退火35－37℃，30－60s。变性和延伸温度一般没有太大变化，而退火温度影响较大。退火温度低，引物和模板结合特异性较差，出现的条带可能增多；退火温度高，引物和模板结合特异性增加。有人提出，在寻找基因差异为目的的实验中，退火采用33－34℃效果更好。在优化方案中，退火温度可能要提高，以便降低背景，得到少而清晰的＂带＂。温度的梯度率也是十分重要的，特别是退火与延伸之间的梯度尤为重要。各种仪器的控温、升降温性能均有差别，一些仪器（如一些旧型号的仪器）在到达特定的温度前就开始计时，一些PCR仪显示的温度与实际温度会有差异。这些在设计程序和结果分析时有必要考虑，所以注明所用仪器的生产厂家、品牌、规格，就显得很有必要，对于同一批实验，注意控制在同样的温度条件下进行反应，结果才有可比性。