男女呻吟久久免费视频 细胞弹性蛋白含量比色法（TPPS）定量检测试剂盒产品说明书

【资料简介】

细胞弹性蛋白含量比色法（TPPS）定量检测试剂盒 产品说明书

主要用途

细胞弹性蛋白含量比色法（TPPS）定量检测试剂 是一种旨在通过酸性加热萃取并转化为可溶性弹性蛋白，与 四苯基卟吩四磺酸 染料结合，在碱性条件下，释放 棕红色染料 ， 酸性处理后， 由分光光度仪比色分析，定量检测细胞样品中弹性蛋白 含量 的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以用于检测各种弹性蛋白，包括原弹性蛋白（tropoelastin）、 致山黧豆中毒弹性蛋白（lathyrogenic）、 α弹性蛋白、k-弹性蛋白等。适用于各种细胞（动物、人体等）或培养上清 弹性蛋白水平 检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测准确。

技术背景

弹性蛋白（elastin）是一种不溶性的非极性的碱性蛋白，具有高度抗拉能力（tensile strength），存在于大动脉、气管、支气管、韧带等结缔组织细胞间。弹性蛋白由多肽二价交联随机扭绞（randomly kinked）组成，通过锁链素（desmosine）和异锁链素（isodesmosine）相连。动物细胞上的原弹性蛋白（tropoelastin）为单体，可溶性，分子量为62至72Kd。与微纤丝（microfibril）糖蛋白结合，形成弹性基质（matrix）或弹性组织筏（raft），构成细胞膜表面。通过酸性加热萃取弹性蛋白，并转化为可溶性衍生物，α弹性蛋白、k-弹性蛋白等，进而使用 四苯基卟吩四磺酸 （5,10,15,20-tetraphenyl porphin-21H,23H- tetra-sulfonate；TPPS）染料与弹性蛋白发生温克尔曼反应（Winkelman reaction）结合，然后在碱性条件下 释放出棕红色染料， 酸性处理后，呈现绿色， 通过分光光度仪（ 445 nm波长）测定，分析弹性蛋白的含量。

产品内容

萃取 液（Reagent A） 毫升

沉淀 液（Reagent B）  毫 升

清理 液（Reagent C ）  毫 升

染色 液（Reagent D ） 毫升

浓缩 液（Reagent E ） 毫升

解离 液（Reagent F ）  毫升

强化 液（Reagent G ）  毫升

标准 液（Reagent H ）  毫 升

稀释 液（Reagent I ）  毫 升

产品说明书 1 份

保存方式

保存 标准 液（Reagent H） 在－ 20 ℃ 冰箱里 ， 其余的保存在 4 ℃ 冰箱里 ； 染色 液（Reagent D ） 避免光照 ； 试剂具有腐蚀性，注意操作安全； 有效保证 6 月

用户自备

1.5毫升离心管：用于标准液配制和样品制备的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

细胞刮脱棒：用于细胞脱离

平式摇荡仪：用于样品操作

干式恒温仪：用于样品孵育

微型台式离心机：用于样品操作

200 微升 1 厘米光径比色皿或 96 孔板：用于比色分析的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

一、样品预处理

1）细胞上清处理

• 移取300微升细胞培养上清到1.5毫升离心管
• 加入xx微升 萃取液（Reagent A）
• 涡旋振荡15秒
• 放进100 ℃ 干式恒温仪孵育60分钟
• 置于室温下15分钟冷却
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心移取400微升上清液到新的1.5毫升离心管
• 加入xx微升4 ℃ 预冷的 沉淀液（Reagent B）
• 在冰槽里孵育30分钟，期间每隔10分钟涡旋振荡15秒
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心抽去上清液，确保无液体残留；沉淀颗粒透明且肉眼难以看见
• 置于冰槽里备用

2）细胞处理

• 准备好 25cm ² 细胞培养瓶或 60mm 细胞培养皿的待测培养细胞（ 1 至 5 X 10 ⁶ 细胞）
• 小心抽去培养液
• 小心加入 xx 毫升 清理液（ Reagent C ） ，覆盖生长表面
• 小心抽去清理液
• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意： 可以 使用胰酶消化 ）
• 加入 xx 毫升 清理液（ Reagent C ） ，混匀细胞
• 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管（注意： 悬浮细胞从这一步骤开始 ）
• 放进台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g
• 小心抽去上清液 ，但保留300微升，混匀细胞颗粒群
• 转移到1.5毫升离心管
• 加入xx微升 萃取液（Reagent A）
• 涡旋振荡15秒
• 放进100 ℃ 干式恒温仪孵育60分钟
• 置于室温下15分钟冷却
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心移取400微升上清液到新的1.5毫升离心管（注意：上清液可能会呈现黄色）
• 加入xx微升4 ℃ 预冷的 沉淀液（Reagent B）
• 在冰槽里孵育30分钟，期间每隔10分钟涡旋振荡15秒
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心抽去上清液（注意：确保无液体残留；沉淀颗粒透明且肉眼难以看见）
• 置于冰槽里备用

二、标准样品配制

• 准备好 5 个 1.5 毫升离心管，标记为 1 至 4 号管
• 分别加入 xx 微升 稀释 液（ Reagent I ） 到 1 至 4 号管
• 移取 xx 微升 标准液（ Reagent H ） 到 1 号管 ，混匀
• 小心移取 xx 微升 1 号管 稀释 的 标准液（ Reagent H ） 到 2 号管，混匀
• 小心移取 xx 微升 2 号管稀释的 标准液（ Reagent H ） 到 3 号管，混匀
• 小心抽去 xx 微升 3 号管稀释的 标准液（ Reagent H ）
• 将 1 至 4 号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

管号	稀释 液（ Reagent I ）	标准液（ Reagent H ）	标准 弹性蛋白 含量
1	xx 微升	xx 微升	xx微克
2	xx 微升	xx 微升 1 号管	xx微克
3	xx 微升	xx 微升 2 号管	xx微克
4	xx 微升	背景读数	0

• 分别加入xx微升4 ℃ 预冷的 沉淀液（Reagent B） 到上述标准管里
• 在冰槽里孵育30分钟，期间每隔10分钟涡旋振荡15秒
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心抽去上清液（注意：确保无液体残留；沉淀颗粒透明且肉眼难以看见）
• 置于冰槽里备用

• 标准曲线测定

• 分别加入xx微升 染色液（Reagent D） 到 上述配制的 标准液（ Reagent H ） 里（注意：用枪头抽打使沉淀颗粒溶解）
• 分别加入xx微升 浓缩液（Reagent E）
• 涡旋振荡混匀
• 室温下，孵育60分钟， 期间每隔15分钟涡旋振荡15秒
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心抽去上清液（注意：确保没有液体残留）
• 加入xx微升 解离液（Reagent F）
• 用枪头抽打使沉淀颗粒溶解 ，并辅以 涡旋震荡（注意：确保充分溶解）
• 加入xx微升 强化液（Reagent G） ，混匀（注意：呈现绿色）
• 转移到新的200微升1厘米光径的比色皿或96孔板
• 即刻放进分光光度仪或酶标仪检测（波长445nm）：获得标准样品吸光读数
• 重复实验步骤 1 至 11 四次
• 构建标准曲线：纵座标（ Y 轴）为吸光读数；横座标（ X 轴）为标准 弹性蛋白 含量 （ 微克 ） （注意： 标准样品吸光读数—背景读数）

• 样品测定

• 加入xx微升 染色液（Reagent D） 到 上述配制的 待测样品管 里（注意：用枪头抽打使沉淀颗粒溶解）
• 分别加入xx微升 浓缩液（Reagent E）
• 涡旋振荡混匀
• 室温下，孵育60分钟， 期间每隔15分钟涡旋振荡15秒
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心抽去上清液（注意：确保没有液体残留）
• 加入xx微升 解离液（Reagent F）
• 用枪头抽打使沉淀颗粒溶解 ，并辅以 涡旋震荡（注意：确保充分溶解）
• 加入xx微升 强化液（Reagent G） ，混匀（注意：呈现绿色）
• 转移到新的200微升1厘米光径的比色皿或96孔板
• 即刻放进分光光度仪或酶标仪检测（波长445nm）：获得样品吸光读数
• 根据上述标准曲线 获得样品对应弹性蛋白 含量 （微克） （注意： 待测样品吸光读数—背景读数）

• 浓度计算

注意事项

• 本产品为 25 次操作 ，包括标准样品
• 本产品检测范围为5至100微克弹性蛋白
• 操作时，须戴手套
• 系统操作时，标准样品测定只需1次
• 弹性蛋白沉淀颗粒微小透明，肉眼难以看见
• 操作需要非常细致，包括避免液体残留、颗粒溶解等，否则会产生误差
• 试剂具有腐蚀性，严格注意操作安全
• 孵育时，避免光照
• 如果样品弹性蛋白含量过低，可以浓缩样品或增加样品量
• 样品浓度可以表述为：微克弹性蛋白/细胞量；微克弹性蛋白/细胞总蛋白等
• 通常1 X 10 ⁵ 细胞含有40微克弹性蛋白
• 本公司提供系列 弹性蛋白检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定 检测敏感