牛牛天天人人综合影院 *琼脂糖凝胶使用说明

【资料简介】

Pgex载体表达的外源蛋白与*S-转移酶溶合，因此可以通过*-琼脂糖亲和层析进行纯化。Pgex是一类以*（γ-*半胱胺酰*）作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST对底物的亲和力是亚豪摩尔级的，因此*固化琼脂糖形成的亲和层析树脂GST及其融合蛋白的纯化效率很高。可以用含游离*的缓冲液洗脱结合GST融合蛋白。树脂用3mol/L NaCl的缓冲液再生。
*琼脂糖对GST融合蛋白的结合能力很强（每毫升柱床体积的树脂能结合8毫克融合蛋白）。
*树脂的处理
1. 轻轻颠倒盛有*-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆
2. 取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml 细菌培养物需要2ml匀浆）
3. 4℃ 500 g离心5分钟，小心去掉上清。
4. 在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS，颠倒数次，混合均匀，4℃ 500 g离心5分钟，小心去掉上清。
5. 每毫升树脂加入1毫升冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用
制备细胞抽提物
6. 每100毫升培养基的细胞沉淀悬于4mlPBS
7. 加入*至终浓度1mg/ml,冰上放置30分钟
8. 用针筒将10ml 0.2%TritonX-100 强行注入黏的细胞裂解物中，剧烈振动数次均匀。加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃振动温育10分钟，4℃3000g离心30分钟，去除不溶性细胞碎片，上清转移到一只新管中，加入DTT至终浓度1mmol/L
纯化融合蛋白
9. 细胞裂解物与适量50%*-琼脂糖树脂匀浆混合，每100毫升细菌培养物加2ml树脂，于室温轻摇30min
10. 混合物于4℃以500g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
11. 沉淀中加入10倍柱床体积的冷的PBS，颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白。
12. 4℃以500g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
13. 重复步骤11和12两次
14. 合的GST融合蛋白可用*洗脱缓冲液洗脱，也可用*、肠激酶或Xa因子切割，
用*洗脱融合蛋白
a. 沉淀中加入1倍柱床体积的*洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白。
b. 如步骤12离心，上清（含洗脱的融合蛋白）移至管中。
c. 重复步骤a和b，合并三次上清。
蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上挥手靶蛋白
a. 在结合了融合蛋白的树脂中加入*、肠激酶或Xa因子（根据融合蛋白中的位点选择），每ml树脂加入50单位溶于1mlPBS的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡2-16小时。用小规模试验确定时间。
b. 4℃以500g离心5分钟，上清小心移至新管中。（GST仍结合在树脂上，而靶蛋白也在上清中，仍需要奋力）
15. 10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每一步样品的蛋白质组成
试剂配制
*洗脱缓冲液：10mmol/L还原型*
50mmol/L Tris-Cl（PH8.0）