牛牛天天人人综合影院 Western Blot之膜的选择

【资料简介】

Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）和PVDF膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。

选择的根据主要有：

a. 膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；

b. 不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；

c. 如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。

列表形式对主要的三种膜进行比较。

	NC膜	尼龙膜	PVDF膜
灵敏度和分辨率	高	高	高
背景	低	较高	低
结合能力	80－110 ug/cm2	>400 ug/cm2	125－200 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）
材料质地	干的NC膜易脆	软而结实	机械强度高
溶剂耐受性	无	无	有
操作程序	缓冲液润湿,避免气泡	缓冲液润湿	使用*%甲醇润湿
检测方式	常规染色，可用放射性和非放射性检测	不能用阴离子染料	常规染色， 比较于NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，质谱分析和快速免疫检测。
适用范围	0.45um 一般蛋白	0.2um一分子量小于20kD蛋白	0.1um一分子量小于7kD蛋白  低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖（主要用在核酸检测中）   糖蛋白检测和蛋白质测序。
价格	价格较便宜	便宜	较贵

硝酸纤维素膜

硝酸纤维素膜是蛋白印迹zui广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很简便，不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间，不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途——因为经不起多次“折磨”。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话选择0.1um的膜。另外还要注意选择纯的NC膜——混有含醋酸纤维（CM）的NC膜结合力会有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果）。一般而言，NC膜越纯，其蛋白结合能力就越高，所以要增加WB的灵敏度和分辨率，提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。如果NC膜搀杂一些醋化纤维素——这在前面已经提到，会影响蛋白质结合。Protran由于是纯NC膜，比较脆，机械耐受力欠佳，需要小心操作，如果担心自己“粗手粗脚”，那么就可以考虑一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著称的BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane。卷膜肯定是*的选择，只不过要自己动手裁剪——切记，必须带手套操作。

PVDF 膜

与硝酸纤维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更*的性能。市售硝酸纤维素膜的典型结合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜结合量是100-200μg/cm2（而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍！）。但是PVDF膜zui大的优点不仅于此：更好的机械强度和化学耐受性使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；而且单个凝胶的泳道复本可用于多种目的，特别是需要做N端蛋白测序，在相当“严酷”的清洗条件下，当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。所以PVDF也是要做蛋白测序的*选择。但不适合荧光。PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡，才能用，而且适用过程中万一干了也要同样程序再处理（不过要真出现这种问题也是自己欠扁，谁要你不小心呢，转膜前处理也就罢了，转膜后再这样处理可能会影响后继的抗体识别呢）。PVDF膜同样分0.45um和0.2um的，后者孔径小，对小分子蛋白有较好的拦截吸附，背景可能会比前者稍高。

卷膜经济实惠，裁剪剩下的边角料还可以用来做点杂交。再次强调的是，疏水PVDF膜在用前必须经过50%或以上体积比的甲醇或者乙醇溶液处理几分钟，待膜变成半透明后用纯水漂洗一下，转入电泳缓冲液平衡才能用。