牛牛天天人人综合影院 丙酮酸脱羧酶（PDC）活性测定试剂盒

【资料简介】

测定意义：

PDC 主要存在于酵母中，是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙酮酸脱羧生成乙醛。

测定原理：

PDC 催化丙酮酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ ADH ）来进一步催化 NADH 还原乙醛生成乙醇和 NAD⁺ ； NADH 在 340 nm 有吸收峰，而 NAD⁺ 没有；通过测定 340 nm 光吸收下降速率，来计算 PDC 活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计 / 酶标仪、微量石英比色皿 /96 孔板、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 ×1 瓶， 4 ℃ 保存。

试剂二：液体 ×1 瓶， 4 ℃ 保存。

试剂三：液体 ×1 瓶， 4 ℃ 保存。

试剂四：液体 ×1 瓶，﹣ 20 ℃ 保存。

混合试剂：临用前配制，小心把试剂四转移到试剂三中，充分溶解。

试剂六：液体 ×1 管， 4 ℃ 保存。

粗酶液提取：

称取约 0.1g 样品，加试剂一 1 mL ，冰上充分研磨， 16000g 4 ℃ 离心 20min ，取上清液，待测。

PDC 测定操作：

1. 分光光度计预热 30min 以上，调节波长到 340 nm ，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于 25 ℃ 水浴中预热 30min 以上。

3. 空白管： 依次在微量石英比色皿 /96 孔板中加入 20μL 蒸馏水、 20μL 混合试剂、 140μL 试剂二和 20μL 试剂六，迅速混匀后于 340nm 比色，记录 15s 和 75s 的吸光值，分别记为 A1 和 A2 。

4. 测定管： 依次在微量石英比色皿 /96 孔板中加入 20μL 上清液、 20μL 混合试剂、 140μL 试剂二和 20μL 试剂六，迅速混匀后于 340nm 比色，记录 15s 和 75s 的吸光值，分别记为 A3 和 A4 。

PDC 活性计算：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（ 1 ）按蛋白浓度计算

活性单位定义： 25 ℃ 中，每毫克蛋白每分钟催化 1μmol NADH 氧化为 1U 。

PDC (U/mg prot) ={[(A3 － A4) － (A1-A2)]÷(ε×d)×V 总 ×10⁶}÷(Cpr×V 样 ) ÷T

=1.61×[(A3 － A4) － (A1-A2)]÷Cpr

（ 2 ） 按样本鲜重计算

活性单位定义： 25 ℃ 中，每克样品每分钟催化 1μmol NADH 氧化为 1U 。

PDC (U/g 鲜重 ) ={[(A3 － A4) － (A1-A2)]÷(ε×d)×V 总 ×10⁶}÷ (V 样 ÷V 样总 ×W) ÷T

=1.61×[(A3 － A4) － (A1-A2)]÷W

ε ： NADH 摩尔消光系数， 6.22×10³L/mol/cm ； d ：比色皿光径， 1cm ； V 总：反应体系总体积， 0.2mL=2×10^-4 L ， V 样：加入反应体系中上清液体积， 0.02mL ； V 样总：提取液体积， 1 mL ； Cpr ：蛋白浓度（ mg/mL ），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量试剂盒； W ： 样品质量； T ：反应时间， 1 min 。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下

（ 1 ）按蛋白浓度计算

活性单位定义： 25 ℃ 中，每毫克蛋白每分钟催化 1μmol NADH 氧化为 1U 。

PDC (U/mg prot) ={[(A3 － A4) － (A1-A2)]÷(ε×d)×V 总 ×10⁶}÷(Cpr×V 样 ) ÷T

=3.22×[(A3 － A4) － (A1-A2)]÷Cpr

（ 2 ） 按样本鲜重计算

活性单位定义： 25 ℃ 中，每克样品每分钟催化 1μmol NADH 氧化为 1U 。

PDC (U/g 鲜重 ) ={[(A3 － A4) － (A1-A2)]÷(ε×d)×V 总 ×10⁶}÷ (V 样 ÷V 样总 ×W) ÷T

=3.22×[(A3 － A4) － (A1-A2)]÷W

ε ： NADH 摩尔消光系数， 6.22×10³L/mol/cm ； d ： 96 孔板光径， 0.5 cm ； V 总：反应体系总体积， 0.2mL=2×10^-4 L ， V 样：加入反应体系中上清液体积， 0.02mL ； V 样总：提取液体积， 1 mL ； Cpr ：蛋白浓度（ mg/mL ），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量试剂盒； W ： 样品质量； T ：反应时间， 1 min 。