女人天天干夜夜爽视频 明胶酶谱法检测试剂盒说明书

【资料简介】

MMP-2&MMP-9 女人天天干夜夜爽视频 明胶酶谱法检测试剂盒说明书

MMP Zymography Assay Kit （XF-P17750） 50T

1. 简介：

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无活性的酶原形式分泌，活化后能够降解细胞外

基质的胶原蛋白，又称胶原酶。通过影响细胞外基质，胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等

过程，并参与炎症、肿瘤、、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生

理与病理过程，其在诊断和治疗中的意义日益受到重视。

2. 检测原理：

本试剂盒采用酶谱法(Zymography)检测MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一种广为使用的、基于

SDS-PAGE 电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达1 nM，高于ELISA方法，其基本原理

和程序是：制备加有胶原酶底物的SDS-PAGE 凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳，电泳结束后

取出凝胶与酶反应Buffer 孵育，凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，

但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，从而能

同时指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供MMP-2、MMP-9 特异蛋白底物及酶学

反应缓冲液，可检测少至 0.1~0.5 μl 血液中的 MMP-2 、 MMP-9 酶谱及活性，检测灵敏度 ~1nM 。试剂

盒可进行 50 次标准小胶检测，如果小胶加样孔为 10~15 个，则总计可检测 500~750 个样品。

3. 检测目的:

本试剂盒用于检测MMP-2、MMP-9 酶谱及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM）。

4. 试剂盒组成与储存：

A. 2 ×SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml , −20 ºC ；

B. 10 × Substrate G, 50 ml, −20 ºC ；

C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用时用蒸馏水稀释；

D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用时用蒸馏水稀释；

E. SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液 , 4 ºC 。

5. 检测步骤 ：

5.1 制备含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝胶：分离胶浓度为 8% 。按照标准程序制备 SDS PAGE 凝胶。

将 10 × substrate G 融化，并 90 ºC 加热 5 分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入 10 × substrate G

并使之稀释 10 倍，混匀后加入过硫酸铵和 TEMED ，等待凝胶聚合。

5.2 待测样品 1:1 稀释于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer ( 用完后可自行配制： 4% SDS, 100 mM

Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue) ，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅使

用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染 Marker 即可。

阳性对照 ( 可选步骤 ) ：可取人、小鼠、大鼠或兔 100μl 全血与 100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer

等体积混合，取 5-15μl 上样。

注：因为全血成分复杂 ,MMP 活性较低，*方法是将全血中白蛋白进行分离做阳性对照

5.3 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为 20 mA/gel 。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

5.4 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入 10 ml 1× Buffer A( 用蒸馏水稀释 ) ，室温漂洗凝胶 2 × 18 小时。中间换液。

5.5 孵育：倒掉 Buffer A 。加入 10 ml 1× Buffer B( 蒸馏水稀释 ) ，室温或 37ºC 孵育 1~5 小时。阳性对照或

者血中的 MMP 通常 37ºC 孵育 1 小时即可显示。如 MMP 活性低，应延长孵育时间为 10 小时或过夜。

5.6 显色：倒掉 Buffer B ，加入 SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见后面所附 SDS-PAGE

凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有 MMP 条带的位置不被染色

而形成透亮区域。

透明区域的位置和范围指示 MMP-2 、 MMP-9 的大小位置 ( 酶谱 ) 及活性。阳性对照将在 66~72

(MMP-2) 、 92 (MMP-9) 、 130 (proMMP-9) 、 225 (proMMP-9) kDa 位置出现透明条带。

5.7 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然 MMP 条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可

用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色。 MMP 条带

则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中常见的格式。

6. 说明：

1. 10 mM 能够 EDTA *抑制 MMP 活性。

2. 凝胶干燥：可使用聚丙烯酰胺凝胶干胶装置室温快速干燥凝胶，作为 泳久 记录保留。

7. 参考文献：

1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem , 1999, 274, 21491-21494

2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide

gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem ， 1980,

102,196–202

SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书

常规考马斯亮蓝 SDS-PAGE 凝胶蛋白质染色是实验室常用的凝胶染色方法。银染方法虽然灵敏度高，但

所需试剂复杂并且有毒有害，操作步骤繁琐，难以控制获得好的染色效果。

染色步骤：

1. 此染色液即为工作液，使用时直接将聚丙烯酰胺凝胶放在培养皿中以考马斯亮蓝染色液覆盖凝

胶，并缓慢摇动 2h ；

2. 倾去染色液，用脱色液冲洗凝胶；

3. 以脱色液覆盖凝胶，缓慢摇动 2h ，倾去脱色液，再加入新脱色液进行脱色，直至获得清晰的蓝色的条带

和干净的背景（通常此过程需要 2 ～ 4h ，也可脱色过夜至清晰的蓝色的条带和干净的背景）；

4. 对凝胶进行分析和照相，凝胶可放置在 7 ％的乙酸中保存。也可用凝胶干胶装置（ P2000 ）对

凝胶进行处理后保存。

安全性：含有甲醇，无特殊毒性，按一般化学品操作规程处理。

说明：

1. 染色液配方： 0.25g 考马斯亮蓝 R250+420ml 甲醇 +100ml 冰乙酸，定容至 1000ml ，混合 1h 后用

Whatman 1 号滤纸过滤，于室温可无限期保存；

2. 脱色液配方：冰醋酸 : 甲醇 : 水＝ 7:5:88 （ V:V:V ）；

3. 保存液： 7 ％冰醋酸；

4. 凝胶染色之后，染色液可以回收利用，装入新容器内，室温或 4 ºC 保存，可反复使用 2-4 次。