牛牛天天人人综合影院 成纤维细胞的分离技术

【资料简介】

实验步骤

选择大约一半足孕时间的胚胎， 10-13 天龄胚胎含有zui大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。

1. 胚胎的分离

   1） 适用哺乳动物（仓鼠、小鼠和大鼠）

a. 采用认可的方案处死啮齿动物

b. 立即在无菌超净台内用 70% 乙醇擦洗整个动物。若可能，置紫外灯下照射 5min 。

c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后退。

 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，去除含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上

e. 剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌 PBS 的烧瓶中。

 f. 漂洗胚胎，去掉 PBS 。继续用 PBS 漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

   2） 适用鸡胚胎

 a. 用 70% 乙醇擦洗鸡蛋壳。

 b. 用无菌剪刀轻敲鸡蛋的圆端，轻轻去除蛋壳露出气囊。

 c. 用无菌镊子去除覆盖于绒毛尿囊上的白膜。

 d. 剪开包膜，用弯镊夹住胚胎颈部去除胚胎。

e. 弃头部，将无头的胚胎置于广口烧杯中，用 PBS 漂洗。

2. 将 6-8 个胚胎转移至一个小的无菌广口烧杯中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎，用 PBS 漂洗。

3. 在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一 500ml 的无菌的有搅拌棒的烧杯中，加入 200-300ml 用 HBSS 配制的 0.25% 的无菌*。

4. 在温暖的环境中或置于 37 ℃ 培养箱中轻轻搅动 15min 。

5. 让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌大容积的离心管中，该管内按照每 10ml 上清加入 1ml 牛血清的比例加入牛血清以灭火*。

6. 加入新鲜*溶液（见前述步骤）于含有残留未消化组织块的 500ml 烧杯中，重复步骤 4 和 5 。

7. 离心混合的细胞悬液， 1200r/min ， 5min ，弃上清。

8. 用新鲜的无菌 PBS 重悬沉淀的细胞，按步骤 7 再次离心。

9. 用 PBS 反复洗涤细胞直至上清清亮为止。

10. 用含有 10% 牛血清和抗生素（如*、*）的 DMEM 10ml 再悬沉淀，并使终体积为 100ml 。

11. 让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞快。

12. 为确定现有细胞浓度，加入 0.2ml 细胞悬液于 1.8ml 1% 醋酸溶液中以裂解红细胞，用*进行细胞计数。

13. 按每 10mm 平皿 1*10⁷ 至 4*10⁷ 细胞的数量接种于 10ml 组织培养液中，在饱和湿度的 37 ℃ CO₂ 培养箱中孵育直至细胞铺满。

14 当细胞长满后，去除培养液，用 10% 的温暖的 Versene （用 PBS 配制的 0.53nmol/L EDTA ），洗涤细胞层 2 次。

15. 弃 Versene ，加入相同体积的温暖 0.05% * -EDTA 。

16. 37 ℃ 孵育 5min 。

17. 用无菌吸管轻轻吹散细胞，并转移至一含有 1-2ml 牛血清的无菌管中。牛血清的终浓度约为 10% ，起到中和*的作用。

18. 离心， 1200r/min ， 5min ，弃上清。

19. 再悬沉淀于 5ml 培养液中，另加入 15ml 培养液，分装于 2 个 100mm 平皿中。

20. 置 37 ℃ 饱和湿度的 CO₂ 培养箱中培养细胞，直至细胞长满，继续步骤 14-20 以传代细胞。