牛牛天天人人综合影院 SDS法提取植物基因组DNA

【资料简介】

本方法由Dellaporta,Wood和Hicks(1983)的方法修改而成。其基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后，加入高浓度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质，zui后用乙醇或异丙醇沉淀。
一 材料、试剂和仪器
1 材料 新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料
2 试剂
(1)提取缓冲液
Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0）
EDTA 50mmol/L （pH8.0）
NaCl 500 mmol/L
灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L
(2)裂解液20%SDS
(3)高盐溶液5mol/L KAc
(4) RNAseA 10mg/ml
(5) 异丙醇
(6)灭菌ddH2O或TE
3. 仪器: 离心机， 恒温水浴, 台式高速离心机，电泳装置
二 实验程序
1取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。
2 向管中加入50μL20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂 ，65℃保温10min，并不时摇动。
3 加入150μL 5mol/L KAc，混匀，置冰上20-30 min。
4 4℃,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30 min 。
5 12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。
6 加入1/10体积的RNaseA，37℃保温20min，除去RNA。
7 CI抽提后，加2V乙醇，-20℃沉淀30 min 。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。
8 用400μL 70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。
9 电泳检测完整性。

三、结果分析
1． 用紫外分光光度计在230nm、260nm、 280nm和310nm波长分别读数。其中260nm

用琼脂糖凝胶电泳（0.8%）检测核DNA的完整性(见图2 )。

完整性好的基因组DNA应是一条比23Kb滞后的电泳带, 若降解则成为弥散状。
电泳前缘为未除干净的RNA。
2．如果DNA沉淀呈白色透明状而且溶解后成粘稠状，说明DNA含有较多的多糖类物质，可以在取材前将植物放暗处24hr，以达到去除淀粉的目的。
3. DNA沉淀呈棕色，难以酶切
植物材料含有大量酚类化合物，与DNA共价结合，使DNA呈棕色，并抑制DNA的酶解反应。为防止此情况出现，可在加入2 ×CTAB的同时加入2-5%的巯基乙醇，或者加入亚精胺(100μl DNA加5μl 0.1mol/L的亚精胺）。
4．DNA中含有多糖或盐类
将DNA用乙醇或异丙醇沉淀出来，离心，沉淀用70%乙醇清洗两次或更多次，吹干后重溶于TE中。（注意乙醇一定要吹干, 否则电泳点样时, 样品上漂）
5．DNA已降解电泳条带呈弥散状
样品降解可能有两种情况：一是机械振动过剧烈，二是操作过程中DNase污染。在提取DNA的各个操作过程中要避免剧烈振荡，提取液及用品要高温高压灭菌。另外，使用Tip头吸取过程中应避免产生气泡，Tip头应剪去Tip头尖，避免反复冻融DNA。