科研实验都离不开细胞的培养，细胞培养的好坏关乎实验的zui终结果，下面我们整理了一些难养的细胞培养方法.

1）球体细胞培养：

1. 琼脂铺底的培养瓶：30ml无菌培养瓶，每瓶中加5ml 2%琼脂培养基，冷却，形成平坦底层后备用。 
2.取生长状态良好已连接成片的细胞，用弯头吸管伸入瓶内，把细胞纵横割划成若干小区后，倒出培养液。 
3.加入0.25%的*液，在倒置显微镜下边消化边观察，当细胞小区边缘微卷起后便立即终止消化，倒出消化液，用Hanks轻轻漂洗一次，加入新培养液3~5 ml，用吸管把已松动的细胞片吸打下来，分装入1~3个含2%琼脂培养基底层的培养瓶中，置温箱继续培养，数日后便可生长成细胞球体。 
4.换液：培养1~2日后，如需换液，微倾斜培养瓶，令培养液集于培养瓶底角，停片刻，待球体细胞下沉后，吸除部分培养液，再补充新培养液。 

小鼠胚胎成纤维细胞（cat.No.M7540）

2）胚胎成纤维细胞培养

用人或动物胚体为好；动物可用小鼠或鸡胚，去头和内脏，剪成小碎块后，用*消化法培养；如为人胚，可取皮肤培养。幼儿bao皮是培养成纤维细胞的很好对象。 

大鼠巨噬细胞（Cat.No.R1920）

3）巨噬细胞培养

1．实验前三天，向每只大鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。

2．引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3～5秒。

3．置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。

4．再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。

5．用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。

6．小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g 4℃离心10分钟，去上清，加10 ml Eagle培养基。

7．计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90％为巨噬细胞。

8．为获取3×105个帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。

9．为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃ CO2温箱中培养。

人关节软骨细胞（Cat.No.4650）

4）软骨细胞培养：

骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL-1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等

体外培养软骨细胞的优点是可以大量扩增及研究其生命活动的状况，但要维持其正常表型则 受到众多复杂因素的调控。就其细胞因子而言，细胞因子对体外培养软骨细胞的作用非单一的，而是一个复杂的调节作用，如生长因子的生物学活性是由受体介导的，生长因子在 软骨细胞合成分泌后，多为无活性的前体分子需要经过特异性的激活才能发挥作用。生长因 子之间存在基因表达及其活性的相互调控TGF-β能促进PDGF的A链和B链的mRNA表达和分泌 ［30］。bFGF能促进TGF-β mRNA的表达，诱导间充质细胞分化成软骨细胞，增强 TGF对软骨细胞的增殖及其基质合成作用。生长因子之间还存在受体水平的调控，胰岛素不 影响TGF-Ⅱ型受体的亲和力但增加了Ⅱ型受体的数目引起受体上调效应，从而Ⅱ型受体与 Ⅰ型受体竞争，使胰岛素与Ⅰ型受体结合减少。IL-1可使TNF受体下调，而IFN-γ却使TNF 受体上调等。但是生长因子如何调控体外培养软骨细胞的增殖、分化阻滞反分化或向肥 大型转化、维持其正常软骨细胞表型及合成特异性胞外基质还需进一步的研究。总之软骨细 胞体外培养维持其正常表型则受到众多因素的影响如培养条件及其方式，细胞的微环境，PH 值、细胞密度、力学变化、生长因子等等。

5）微载体细胞培养法  
1.微载体选择：先用利用三种小量微载体做培养实验，观察细胞在一定时间内细胞的吸着率和计算细胞数，以得到zui大量细胞为佳。  
2.水化：称一定量的微载体放入容器中，按每克微载体加50～100ml的比例，加入无Ca2＋和Mg2＋的磷酸缓冲液（PBS），室温下放置应不少于3小时，并不时轻微搅动，然后再用新鲜PBS洗一次。  
3. 消毒：可采用高压蒸汽消毒，也可在水化后用70％酒精浸泡消毒，再用无菌的PBS漂洗一二次。 
4.传代培养：在连续进行微载体培养时，可以不必把细胞从微载体分离下来，可将带有细胞的微载体和新的微载体混合进行培养细胞能移动到新载体上。如果进行其它实验或需要分离细胞进行传代培养时，和常规培养相同，先用EDTA＋*溶液作用使细胞脱离微载体表面。细胞脱离微载体后，可用自然沉降法，即在室温下静止5分钟，微载体将先自沉在底部，细胞大部分仍在上清中，然后离心上清即可得到细胞。如果需要分离程度较高时，需用孔径为100微米的尼龙网或不锈钢网过滤后，再离心滤过液，就可得到较纯净的细胞。