mRNA差异显示技术是由美国波斯顿Dena-Farber癌症研究所的Liang Peng博士和Arthur Pardee博士在1992年创立的[3]。它也称为差示反转录PCR(differential display of reverse transcriptional PCR)简称DDRT-PCR。mRNA差异显示技术是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术,具有简便、灵敏、RNA用量少、效率高、可同时检测两种或两种以上经不同处理或处于不同发育阶段的样品[4],该方法自问世以来已被广泛用于差异表达基因的克隆鉴定研究中。其基本原理是,几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端,都带有一个多聚的腺苷酸结构,即通常所说的poly(A)尾巴。因此,在RNA聚合酶的作用下,可按mRNA为模板,以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到,在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基,除了为A的情况之外,只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征,P. Peng等人设计合成三中不同的下游引物,它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成,用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示,这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。于是,采用这三种引物,可以将整个mRNA群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物对这个cDNA亚群体进行pcr扩增,因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不同mRNA的扩增产物的大小是不同的,可以在测序胶上明显分辨开来,从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片段(如图1)。
随着mRNA差异显示技术的广泛应用,也逐渐显露出一些不足之处,如所得特异性cDNA片段克隆的假阳性的比例较高,差异条带分离困难,获得的差异扩增片段一般在100bp~600bp太短之间,包含大量的非编码序列,不利于同源性比较分析等。
以下是以红豆杉为例进行mRNA差异显示研究的具体操作。