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实验原理：质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb＝且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来zui大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
外源dna片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：
1、带有非互补突出端的片段 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是zui容易克隆的DNA片段。
2、带有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。
3、带有平末端 是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 dna连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。
特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli dna聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3’凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。
一、 材料 PUC，ΛDNA
二、 设备 恒温摇床， 台式高速离心机，
恒温水浴锅， ，
电热恒温培养箱 ， 电泳仪无菌，
超净工作台， 微量移液枪，Tip. eppendorf管。
三、 试剂 10X bf T4 链接酶
琼脂糖 TAE
Marker EB
溴酚兰
四、 连接反应
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