上海劲马实验设备有限公司作者
SYSTEMS
®
中文说明书
UNIONHONEST
酶联免疫吸附测试
Enzyme linked lmmunosorbent Assay
_____________________________________________________________________________________
人
(
Human
)血管内皮细胞生长因子(
VEGF
)
ELISA
检测试剂盒
本试剂仅供研究使用
试验原理
:
VEGF
试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(
ELISA
)
.
已知
VEGF
浓度的标准品、未知浓度的样品
加入微孔酶标板内进行检测。先将
VEGF
和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后,加入亲和素标记过的
HRP
。再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物
A
、
B
,和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中
VEGF
的浓度呈比例关系。
试剂盒内容及其配制
:
试剂盒成份
|
96
孔配置
|
48
孔配置
|
96/48
人份酶标板
|
1
块板(
96T
)
|
半块板(
48T
)
|
塑料膜板盖
|
1
块
|
半块
|
标准品:
480ng/ml
|
1
瓶(
1.0ml
)
|
1
瓶(
0.5ml
)
|
空白对照
|
1
瓶(
1.0ml
)
|
1
瓶(
0.5ml
)
|
标准品稀释缓冲液
|
1
瓶(
8.0ml
)
|
1
瓶(
4.0ml
)
|
生物素标记的抗
VEGF
抗体
|
1
瓶(
8.0ml
)
|
1
瓶(
4.0ml
)
|
亲和链酶素
-HRP
|
1
瓶(
12ml
)
|
1
瓶(
5ml
)
|
洗涤缓冲液
|
1
瓶(
20ml
)
|
1
瓶(
10ml
)
|
底物
A
|
1
瓶(
6.0ml
)
|
1
瓶(
3.0ml
)
|
底物
B
|
1
瓶(
6.0ml
)
|
1
瓶(
3.0ml
)
|
终止液
|
1
瓶(
6.0ml
)
|
1
瓶(
3.0ml
)
|
自备材料
:
1.
蒸馏水。
2.
加样器:
5ul
、
10ul
、
50ul
、
100ul
、
200ul
、
500ul
、
1000ul
。
3.
振荡器及磁力搅拌器等。
4.
样品收集、处理及保存方法
:
1、
血清
……操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后,1000
×
g
离心
10
分钟将血红
细胞迅速小心地分离。
2
、
血浆
……EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000
×
g
离心
30
分钟去除颗粒。
3
、
细胞上清液
……1000
×
g
离心
10
分钟去除颗粒和聚合物。
4
、
组织匀浆
……将组织加入适量生理盐水捣碎。1000
×
g
离心
10
分钟,取上清液。
5
、
保存
……如果样品不立即使用,应将其分成小部分-70℃保存,避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒,检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
操作注意事项
:
●
试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。
●
实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。
●
不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
●
使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物
A
、
B
液时,避免使用带金属部分的加样器。
●
使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
●
底物
A
应挥发,避免长时间打开盖子。底物
B
对光敏感,避免长时间暴露于光下。避免用手接触,有毒。实验完成后应立即读取
OD
值。
●
加入试剂的顺序应一致,以保证所有反应板孔温育的时间一样。
●
按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
安全性
:
1.
避免直接接触终止液和底物
A
、
B
,一旦接触到这些液体,请尽快用水冲洗。
2.
实难中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3.
不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
试剂的准备
:
1.
标准品:标准品的系列稀释应在实验时准备,不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行:
480
ng/ml
|
(6
号标准品)
|
原倍浓度不用稀释直接加入50ul
|
240
ng/ml
|
(5
号标准品)
|
100ul
的原倍标准品加入100ul
的标准品稀释液
|
120
ng/ml
|
(4
号标准品)
|
100ul
的5
号标准品加入100ul
的标准品稀释液
|
60
ng/ml
|
(3
号标准品)
|
100ul
的4
号标准品加入100ul
的标准品稀释液
|
30
ng/ml
|
(2
号标准品)
|
100ul
的3
号标准品加入100ul
的标准品稀释液
|
15
ng/ml
|
(1
号标准品)
|
100ul
的2
号标准品加入100ul
的标准品稀释液
|
0
ng/ml
|
(空白对照)
|
原倍浓度不用稀释直接加入50ul
|
2.
洗涤缓冲液(
50×
)的稀释:蒸馏水
50
倍稀释。
试剂盒性能
:
1.
灵敏度:zui小的检测浓度小于
1
号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数
R
值为
0.990
。
2.
特异性:不与其它细胞因子反应。
3.
重复性:板内、板间变异系数均小于
10%
。
操作步骤
:
1.
使用前,将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫,以免加样时加入大量的气泡,产生加样上的误差。
2.
根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。
3.
加入稀释好后的标准品
50
ul
于反应孔、加入待测样品
50
ul
于反应孔内。立即加入
50
ul
的生物素标记的抗体。盖上膜板,轻轻振荡混匀,
37
℃温育45分钟。
4.
甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
5.
每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃温育30分钟。
6.
甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
7.
每孔加入底物A、B各50ul,轻轻振荡混匀,37℃温育5分钟。避免光照。
8.
取出酶标板,迅速加入
50
ul
终止液,加入终止液后应立即测定结果。
9.
在
450
nm
波长处测定各孔的
OD
值。
结 果 判 断 与 分 析
:
1、
仪器值:于波长
450nm
的酶标仪上读取各孔的
OD
值
2、
以吸光度
OD
值为纵坐标(
Y
),相应的
VEGF
标准品浓度为横坐标(
X
),做得相应的曲线,样品的
VEGF
含量可根据其
OD
值由标准曲线换算出相应的浓度,再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与
OD
值计算出标准曲线的回归方程式,将样品的
OD
值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
3、
检测值范围:
0-480ng
/ml
4、
敏感度:
1.0ng
/ml
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