猪血管生成素2（ANG-2）ELISA试剂盒说明书

猪血管生成素2（ ANG-2）ELISA试剂盒说明书

本试剂盒仅供研究使用

预期应用

ELISA 法定量测定猪血清、血浆或其它相关液体中 ANG-2 含量。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中 ANG-2 水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 ANG-2 、*化的抗 ANG-2 抗体、 HRP 标记的 亲和素 ，经过*洗涤后用底物 TMB 显色。 TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的 ANG-2 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制

1. 酶联板：一块（ 96 孔）

2. 标准品 （冻干品）： 2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml ，盖好后静置 10 分钟以上，然后反复颠倒 / 搓动以助溶解，其浓度为 500 ng/mL ，做系列倍比稀释后，分别稀释成 500 ng/mL ， 250 ng/mL ， 125 ng/mL ， 62.5 ng/mL ， 31.2 ng/mL ， 15.6 ng/mL ， 7.8 ng/mL ，其原液直接作为zui高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度 0 ng/mL ，临用前 15 分钟内配制。

如配制 250 ng/mL 标准品：取 0.5ml 500 ng/mL 的上述标准品加入含有 0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3. 样品稀释液 ： 1 × 20ml/ 瓶。

4. 检测稀释液 A ： 1 × 10ml/ 瓶。

5. 检测稀释液 B ： 1 × 10ml/ 瓶。

6. 检测溶液 A ： 1 × 120ul/ 瓶（ 1 ： 100 ）临用前以检测稀释液 A 1 ： 100 稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔 100ul ），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml 。如 1ul 检测溶液 A 加 99ul 检测稀释液 A 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7. 检测溶液 B ： 1 × 120ul/ 瓶（ 1 ： 100 ）临用前以检测稀释液 B 1 ： 100 稀释。稀释方法同检测溶液 A 。

8. 底物 溶液： 1 × 10ml/ 瓶。

9. 浓洗涤液： 1 × 30ml/ 瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍。

10. 终止液 ： 1 × 10ml/ 瓶（ 2N H ₂ SO4 ）。

标本的采集及保存

1 ．血清：标本请于室温放置 2 小时或 4 ℃ 过夜后于 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测， 或将标本放于 -20 ℃ 保存，但 应避免反复冻融。

2．血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于 2 - 8° C 1000 x g 离心 15 分钟，或 将标本放于 -20 ℃保存，但 应避免反复冻融。

操作步骤

各试剂在使用前平衡至室温。

1. 加样：分别设空白孔、标准孔、 待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品 100 ul ，注意不要有气泡，轻轻混匀，酶标板加上盖， 37 ℃ 反应 120 分钟。

2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。

3. 每孔加检测溶液 A 工作液 100ul ， 37 ℃ ,60 分钟。 洗板 3 次， 350ul/ 每孔，甩干。

4. 每孔加检测溶液 B 工作液 100ul ， 37 ℃ ， 60 分钟，洗板 5 次，甩干。

5. 依序每孔加底物溶液 90ul ， 37 ℃避光 显色 30 分钟（此时肉眼可见标准品的前 3-4 孔有明显的梯度兰色，后 3-4 孔梯度不明显）。

6. 依序每孔加终止溶液 50ul ，终止反应（此时兰色立转黄色）。用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度（ OD 值）。

注 ：

1 ． 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶液及 2NH ₂ SO4 。测量时先用此孔调 OD 值至零。

2 ．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层

吸 水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少 0.4ml 注入孔内，浸泡 1-2 分钟，根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性

本试剂盒可同时检测猪 ANG-2 ，且与其它相关蛋白无交叉反应。

计算

以标准物的浓度为横坐标（对数坐标）， OD 值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

1． 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

2． 一次加样时间控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

3． 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。

4． 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。

5 ．在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

6 ．底物请避光保存。

检测范围：

7.8 ng/mL -500 ng/mL

说明

1 ．试剂盒保存： -20 ℃ （较长时间不用时）； 2-8 ℃ （频繁使用时）。

2 ．有效期： 6 个月

3 ．浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

4 ．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

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