厦门慧嘉生物科技有限公司作者
慧嘉生物-小鼠C肽(C-Peptide)ELISA试剂盒
本试剂盒仅供体外研究使用
预期应用
ELISA 法定量测定小鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中 C 肽 (C-Peptide) 含量。
实验原理
用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗 C-Peptide 抗体的微孔中依次加入标本或标准品、*化的抗 C-Peptide 抗体、 HRP 标记的 亲和素 ,经过*洗涤后用底物 TMB 显色。 TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的 C-Peptide 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度( OD 值),计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板: 一块( 96 孔)
2. 标准品 (冻干品): 2 瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml ,盖好后静置 10 分钟以上,然后反复颠倒 / 搓动以助溶解,其浓度为 4,000 pg/ml ,做系列倍比稀释后,分别稀释 4,000 pg/ml , 2,000 pg/ml , 1,000 pg/ml , 500 pg/ml , 250 pg/ml , 125 pg/ml , 62.5 pg/ml ,样品稀释液直接作为标准浓度 0 pg/ml ,临用前 15 分钟内配制。
如配制 2,000 pg/ml 标准品:取 0.5ml (不要少于 0.5ml ) 4,000 pg/ml 的上述标准品加入含有 0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf 管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
3. 样品稀释液 : 1 × 20ml/ 瓶。
4. 检测稀释液 A : 1 × 10ml/ 瓶。
5. 检测稀释液 B : 1 × 10ml/ 瓶。
6. 检测溶液 A : 1 × 120ul/ 瓶( 1:100 )临用前以检测稀释液 A 1:100 稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔 100ul ),实际配制时应多配制 0.1-0.2ml 。如 10ul 检测溶液 A 加 990ul 检测稀释液 A 的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。
7. 检测溶液 B : 1 × 120ul/ 瓶( 1:100 )临用前以检测稀释液 B 1:100 稀释。稀释方法同检测溶液 A 。
8. 底物溶液 : 1 × 10ml/ 瓶。
9. 浓洗涤液 : 1 × 30ml/ 瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍。
10. 终止液 : 1 × 10ml/ 瓶( 2N H2SO4 )。
11. 覆膜 : 1 × 5 张
标本的采集及保存
1.
血清:全血标本请于室温放置
2
小时或
2.
血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于
2 - 8° C 1000 x g
离心
15
分钟,或
将标本放于
3.
细胞培养物上清或其它生物标本:请
1000 x g
离心
20
分钟,取上清即可检测,
或将标本放于
注:以上标本置
4
℃保存应小于
1
周,
-20
℃或-80℃均应
密封保存
,
-20
℃不应超过3个月,-80℃不应超过6个月;
标本溶血会影响zui后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测;高血脂的标本不需进行特殊处理,可直接检测。
操作步骤
实验开始前,请提前配制好所有试剂;试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,均应用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。建议各实验室在操作前*行预实验以建立*稀释倍数。
1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100ul ,余孔分别加标准品或待测样品 100ul ,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜, 37 ℃ 反应 120 分钟。
为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加检测溶液 A 工作液 100ul (在使用前一小时内配制), 37 ℃,60分钟。
3. 温育 60 分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板 3 次,每次浸泡 1-2 分钟, 350ul/ 每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
4. 每孔加检测溶液 B 工作液(同检测 A 工作液) 100ul , 37 ℃ , 60 分钟。
5. 温育 60 分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板 5 次,每次浸泡 1-2 分钟, 350ul/ 每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
6. 依序每孔加底物溶液 90ul , 37 ℃避光 显色 ( 30 分钟内,此时肉眼可见标准品的前 3-4 孔有明显的梯度兰色,后 3-4 孔梯度不明显,即可终止)。
7. 依序每孔加终止溶液 50ul ,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度( OD 值)。 在加终止液后立即进行检测。
注 :
1. 每次实验留一孔作为空白调零孔(不同于空白孔),该孔不加任何试剂,只是zui后加底物溶液及 2N H2SO4 。测量时先用此孔调 OD 值至零。
2. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温。使用后立即冷藏保存试剂。
3. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入检测溶液 B 或底物前确保尽量吸干孔内液体。为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜,以避免液体蒸发;洗板后应尽快进行下步操作,避免酶标板长时间处于干燥状态。
4. 消除板底残留的液体和手指印,否则影响 OD 值。
5. 在储存和温育时避免强光直接照射。
6.
未使用完的酶标板或者试剂,请于
2
7. 建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层
吸
水
纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少 0.3ml 注入孔内,浸泡 1-2 分钟,根据需
要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的小鼠 C 肽 (C-Peptide) ,且与其它相关蛋白无交叉反应。
计算
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标), OD 值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线(推荐使用专业制作曲线软件进行分析,如 curve expert 1.3 ),根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的回归方程式,将样品的 OD 值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。
2. 一次加样时间控制在 5 分钟内,如标本数量多,推荐使用多道移液器加样。
3. 请每次测定的同时做标准曲线,做复孔。
4. 如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请zui后乘以稀释倍数。
5. 在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。
6. 底物请避光保存。
检测范围: 62.5 pg/ml - 4,000 pg/ml
zui低检测限 : 15.6 pg/ml
说明
1.
在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染,试剂避免受到微生物的污染,因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
2.
小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本
/
标准品,酶结合物或底物时,*个孔与zui后一个孔加样之间的时间间隔如果太大,将会导致不同的
“预孵育”时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且,洗涤不充分将影响试验结果。
3.
试剂盒保存:短期(
2
周以内)以标签上的标示为准,长期保存请将试剂全部保存于
-20
℃
。
4.
浓洗涤液会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。
5.
刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。
6.
中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。
7.
所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。
8.
有效期:
6
个月
厦门慧嘉生物科技有限公司专业
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ELISA
试剂盒
、免疫组化试剂盒、
一抗二抗
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型号:HG5系列
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