猪γ干扰素（IFN-γ）ELISA试剂盒使用说明书

猪γ干扰素 （IFN- γ ）ELISA 试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用

检测范围： 0.8 ng/ml, - 50 ng/ml,

zui低检测限： 0.2 ng/ml,

特异性： 本试剂盒可同时检测天然或重组的猪 IFN-γ ，且与其他相关蛋白无交叉反应。

有效期： 6 个月

预期应用： ELISA 法定量测定猪血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中 IFN-γ 含量。

说明

l 试剂盒保存： -20 ℃ （较长时间不用时）； 2 -8 ℃ （频繁使用时）。

l 浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

l 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

l 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

实验原理

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗 IFN-γ 抗体的微孔中依次加入标本或标准品、*化的抗 IFN-γ 抗体、 HRP 标记的 亲和素 ，经过*洗涤后用底物 TMB 显色。 TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的 IFN-γ . 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制

1. 酶联板 （Assay plate ） ： 一块（ 96 孔）。

2. 标准品 （ Standard ）： 2 瓶 （ 冻干品 ） 。

3. 样品稀释液 （Sample Diluent ） ： 1×20ml/ 瓶。

4. *标记抗体稀释液（ Biotin-antibody Diluent ） ： 1×10ml/ 瓶。

5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（ HRP-avidin Diluent ） ： 1×10ml/ 瓶。

6. *标记抗体（ Biotin-antibody ） ： 1×120μl/ 瓶（ 1 ： 100 ）。

7. 辣根过氧化物酶标记亲和素（ HRP-avidin ） ： 1×120μl/ 瓶（ 1 ： 100 ）。

8. 底物溶液（ TMB Substrate ） ： 1×10ml/ 瓶。

9. 浓洗涤液（ Wash Buffer ） ： 1×20ml/ 瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍。

10. 终止液（ Stop Solution ） ： 1×10ml/ 瓶（ 2N H₂SO4 ）。

需要而未提供的试剂和器材

1. 标准规格酶标仪

2. 高速离心机

3. 电热恒温培养箱

4. 干净的试管和 Eppendof 管

5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器

6. 蒸馏水，容量瓶等

标本的采集及保存

1. 血清：全血标本请于室温放置 2 小时或 4 ℃ 过夜后于 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测， 或将标本放于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 保存，但 应避免反复冻融。

2. 血浆：可用 EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后 30 分钟内于 2 - 8° C 1000 x g 离心 15 分钟，或 将标本放于 -20 ℃或 -80 ℃保存，但 应避免反复冻融。

3. 细胞培养物上清或其它生物标本： 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测， 或将标本放于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 保存，但 应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

标本的稀释原则：

首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。zui后计算浓度时，稀释了 “N” 倍，标本的浓度应再乘以 “N” 。

标准品的稀释原则： 2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml ，盖好后静置 10 分钟以上，然后反复颠倒 / 搓动以助溶解，其浓度为 50 ng/ml, ，做系列倍比稀释后，分别稀释 50 ng/ml, 25 ng/ml, 125 ng/ml, 6.2 ng/ml, 3.1 ng/ml, 1.6 ng/ml, 0.8 ng/ml. ，样品稀释液直接作为标准浓度 0 ng/ml, ，临用前 15 分钟内配制。

如配制 25 ng/ml, 标准品：取 0.5ml （不要少于 0.5ml ） 50 ng/ml, 的上述标准品加入含 0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

*标记抗体的稀释原则：

临用前以*标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔 100μl ），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml 。如 10μl *标记抗体加 990μl *标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：

临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔 100μl ），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml 。如 10μl 辣根过氧化物酶标记亲和素加 990μl 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100μl ，余孔分别加标准品或待测样品 100μl ，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜， 37 ℃ 反应 120 分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加*标记抗体工作液 100μl （取 1μl *标记抗体加 99μl *标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制）， 37 ℃ ,60 分钟。

3. 温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分钟， 200μl/ 每孔，甩干。

4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同*标记抗体工作液） 100μl ， 37 ℃ ， 60 分钟。

5. 温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分钟， 200μl/ 每孔，甩干。

6. 依序每孔加底物溶液 90μl ， 37 ℃ 避光显色（ 30 分钟内，此时肉眼可见标准品的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色，后 3-4 孔梯度不明显，即可终止）。

7. 依序每孔加终止溶液 50μl ，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8. 用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度（ OD 值）。 在加终止液后 15 分钟以内进行检测。

实验备注

l 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。

l 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶液及 2N H₂SO4 。测量时先用此孔调 OD 值至零。

l 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。

l 未使用完的酶标板或者试剂，请于 2 -8 ℃ 保存。标准品、*标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、*标记抗体工作液、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。

l 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少 0.3ml 注入孔内，浸泡 1-2 分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

计算

以标准物的浓度为横坐标（对数坐标）， OD 值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

l 底物请避光保存。

l 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。

l 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。

l 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

l 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。

l 一次加样时间控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

l 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

l 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。

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