质粒

定义　　质粒（ plasmid ）是细菌拟核裸露 DNA 外的遗传物质，为双股闭合环形的 DNA, 存在于细胞质中，质粒编码非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。

特征

　　是真核细胞 细胞核 外或 原核生物 拟核区外能够进行自主复制的 遗传 单位，包括真核生物的 细胞 器（主要指线粒体和叶绿体）中和 细菌 细胞拟核区以外的环状 脱氧核糖核酸 （DNA） 分子。现在习惯上用来专指细菌 （ 大肠杆菌 ）、 酵母菌 和 放线菌 等生物中细胞核或拟核中的 DNA 以外的 DNA 分子。在 基因工程 中常被用做基因的 载体 （Vector） 。许多细菌除了拟核中的 DNA 外，还有大量很小的环状 DNA 分子，这就是 （plasmid） （补充：部分为 RNA ）。上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或 卡那霉素 抗性基因等。有些称为附加体 （episome） ，这类能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的 DNA 分子。在宿主细胞体内外都可复制！

　　目前，已发现有的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌都是闭合环状 DNA 分子 （ 简称 cccDNA） 。细菌的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的 0.5% ～ 3% 。根据相对分子质量的大小，大致上可以把分成大小两类：较大一类的相对分子质量是 40×106 以上，较小一类的相对分子质量是 10×106 以下 （ 少数的相对分子质量介于两者之间 ） 。每个细胞中的数主要决定于本身的复制特性。按照复制性质，可以把分为两类：一类是严紧型，当细胞染色体复制一次时，也复制一次，每个细胞内只有 1 ～ 2 个；另一类是松弛型，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有 20 个左右。这些的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有 10-200 份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使 拷贝数 增至几千份。如较早的 pBR322 即属于松弛型，要经过 氯霉素 处理才能达到更高拷贝数。一般分子量较大的属严紧型。分子量较小的属松弛型。的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些在大肠杆菌内的 复制 属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。

培养

　　在基因工程中，常用人工构建的作为载体。人工构建的可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工 运载体 有 pBR322 、 pSC101 。 pBR322 含有抗 四环素 基因 （Tcr） 和抗 氨苄青霉素 基因 （Apr） ，并含有 5 种内切酶的单一切点。如果将 DNA 片段插入 EcoRI 切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将 DNA 片段插入到 Hind III 、 Bam H I 或 Sal I 切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有 DNA 插入片段的 pBR322 将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有 DNA 插入片段的 pBR322 会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有 pBR322 的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。 pSC101 与 pBR322 相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和 PstI 切点。运载体的zui大插入片段约为 10 kb（kb 表示为千碱基对 ） 。

1973 年，科学家将作为基因的载体使用，为基因工程的诞生奠定了基础。

　　zui常用的是大肠杆菌的。这种常含有抗生素抗性基因，例如，卡那霉素抗性基因。

pBR322

pBR322 DNA 分子的长度为 4363bp ，此载体中有两个 标记基因 ，一个是氨苄青霉素抗性基因（ Apr ），另一个是四环素抗性基因（ Tetr ）。现在已知 pBR322DNA 分子共有 24 种核酸内切限制酶的单一识别位点。其中 7 种限制酶（从 12 ： 00 位置按顺时针方向）即 EcoRV 、 NheI 、 BamHI 、 SphI 、 SalI 、 XmaIII 和 NruI 的识别位点位于四环素抗性基因内部，另

　　外有 2 种限制酶即 ClaI 和 HindIII 的识别位点是存在于这个基因的启动区内，在这 9 个限制位点上插入外源 DNA 都会导致 tetr 的失活。 3 种限制酶即 ScaI 、 PvuI 和 PstI 的识别位点位于氨苄青霉素抗性基因内，在这些位点插入外源 DNA 则会导致 ampr 基因的失活。由 pBR322 载体 的结构可知其具有如下优点：（ 1 ）具有较小的分子量。经验表明，为了避免在 DNA 的纯化过程中发生链的断裂， 克隆载体 的分子大小不要超过 10Kb 。 pBR322 这种小分子量的特点，不仅易于自身 DNA 的纯化，而且可容纳较大的外源 DNA 片段；（ 2 ）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组 DNA 分子是否进入宿主细胞以及外源 DNA 分子是否插入载体分子形成了重组子。标记基因往往可以赋予宿主细胞一种新的表型，这种转化细胞可明显地区别于非转化细胞。当我们把一个 DNA 片段插入到某一个标记基因内时，该基因就失去了相应的功能。当把这种重组 DNA 分子转到宿主细胞后，该基因原来赋予的表型也就消失了。要是仍保留了原来表型的转化细胞，细胞内含有的 DNA 分子一定不是重组子。很显然，既要指示外源 DNA 是否进入了宿主细胞，又要指示载体 DNA 分子中是否插入了外源 DNA 片段，那么这种载体必须至少具有两个标记基因。另外， pBR322 载体还具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可积累 1000~3000 个拷贝，这就为重组体 DNA 的制备提供了极大的方便。

pBR322 载体的构建

pBR322 载体的构建过程可简单地概括如下：

1 、由于 pBR322 的亲本之一是 pMB1 ，故首先以 pMB1 为基础，引入 Rldrd19 的 Tn3 易位子，得到 13.3kb 的 pMB3 ；

2 、 pMB3 的分子量显然使得它不适合作为载体，所以要通过在 EcoRI 活性条件下的消化让它大部分的无用片段失去，留下来的小片段的 DNA 的黏性末端连接起来后就形成了 pMB8 （ 2.6kb ）；

3 、此时，另外一种 pSC101 在 EcoRI 活性条件下消化产生了含有 tetr 抗性的 DNA 片断，这个片断和 pMB8 整合在一起就形成了 pMB9 （ 5.3kb ）。此时 pMB9 为 ampstetr 表型；

4 、 pMB9 已经初步具备载体的功能，为了让它更加完善，我们要让它具备 amprtetr 性能，即在 pMB9 上引入 pSF2124 的 Tn3 易位子，但 Tn3 可以来也可以走，为了留住它，我们切去了 Tn3 中表达转位酶的基因，形成了 pBR313 。

　　此后我们兵分两路：一路把 pBR313 的 PstI 位点除去，使之成为 ampstetr 表型的 pBR318 ；

5 、；另一路把 pBR313 的 EcoRII 的位点切除，使之成为 amprtets 表形的 pBR320 。

　　由此我们的到了两种功能互补的，这样我们只要将他们杂交就可以得到一种接近的载体了，这就是 pBR322 。

pBR322 的应用

　　了解了 pBR322 的结构和它的构建过程之后，我们来看 pBR322 在基因工程中的应用。

pBR322 作为一种常用的 基因克隆 载体，在实际应用中有着非常重要的地位，其中一个突出的例子就是应用 pBR322 作为克隆载体对水稻的叶绿体光诱导基因 psbA 进行结构分析。

　　将水稻叶绿体的 DNA ，用 EcoRI 核酸 限制性内切酶 消化之后，放入含有溴化乙锭的低熔点（ LMP ）的 1% 琼脂糖凝胶中作电泳分离。从 LMP 中分离出分子大小为 1.8 ～ 2.5kb 之间的 DNA 片段，再与同样经过了 EcoRI 核酸限制性内切酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理的 pBR322 连接。然后，将混合物转化到大肠杆菌 5346 菌株，培养在氨苄青霉素选择平板上，形成 Ampr 转化子菌落群体。这样就构成了由 EcoRI 核酸限制性内切酶切割的水稻叶绿体 DNA 基因组 库。用 Ampr 转化子菌落与 32P 放射性标记的玉米 psbA DNA 探针作菌落杂交，可以分离出其中的阳性克隆体。从这些阳性克隆体中分离出来的重组体 DNA ，经过进一步的分析，就能测出水稻叶绿体基因 psbA 的序列。

　　利用 pBR322 作为载体重组人体的抑 生长激素 也是一个经常提到的应用例子。其过程和水稻叶绿体基因重组大同小异，只是除了在载体上插入抑生长激素基因外，还将含有 lac 操纵子起始部分的片段（包括 启动子 、操纵区、核糖体结合位点和 β －半乳糖苷酶的主要部分）插在抑生长激素基因的旁边。由于有了 lac 操纵子的控制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了。